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猪 FSH ELISA试剂盒操作说明

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2017/6/12 9:37:32

本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中猪促卵泡素(FSH)的含量。
有效期:6个月
保存条件:2-8℃


实验原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被猪促卵泡素(FSH)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并*洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的猪促卵泡素(FSH)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。

样本处理及要求
1.  血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过一夜,然后1000×g离心20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
2.  血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
3.  组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。zui后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。
4.  细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
注:标本溶血会影响zui后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

需要而未提供的试剂和器材
1.酶标仪(450nm)
2.高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱
4.蒸馏水或去离子水
 
试剂盒组成

名称    96孔配置    48孔配置    备注
微孔酶标板    8孔×12条    8孔×6条    无
标准品    0.3mL*6管    0.3mL*6管    无
样本稀释液    6mL    3mL    无
检测抗体-HRP    10mL    5mL    无
20×洗涤缓冲液    25mL    15mL    按说明书进行稀释
底物A    6mL    3mL    无
底物B    6mL    3mL    无
终止液    6mL    3mL    无
封板膜    2张    2张    无
说明书    1份    1份    无
自封袋    1个    1个    无
备注:
1.  标准品浓度依次为:24、12、6、3、1.5、0.75 mIU/mL
2.  经过大量正常标本检验,标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内,实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过zui大标准品浓度时,可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

注意事项
1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2.洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3.消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。
4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。
5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6.在储存和温育时避免强光直接照射。
7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9.不能使用过期产品。
10.如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。

试剂准备
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

操作步骤
1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.  设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3.  样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。
4.  除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.  弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.  每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。

试剂盒性能
1. 检测范围:0.75 mIU/mL – 24 mIU/mL。
2. 灵敏度:zui低检测浓度小于0.1 mIU/mL。
3. 特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
 重复性:板内变异系数小于10% ,板间变异系数小于15

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