WB试验之如何选择内参抗体

检测某一个基因的表达产物或者要比较表达产物量的相对变化，方法是western blot。而Western Blot试验中比较这些的前提条件是等量的细胞上样，这样才有比较的基础。而人为的操作会产生一定的误差，这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参来校正。因此选择一个合适的内参抗体来校正上样误差是非常重要的。所以严谨的Western Blot实验设计中需要有良好的参照体系，后续的实验结果分析才具有说服性。

在Western Bloting实验中，可能内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

在Western Blotting 中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否*、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH、beta-actin和beta-tubulin等。对于一些植物的样本，则需要特别的植物Actin蛋白作为内参，同样的，如果提取的样本是细胞核蛋白，那么PCNA或者组蛋白H3都是被经常使用的，而针对一些研究线粒体的客户，那么Cox IV则被较多的文献引用作为线粒体总蛋白的内部参考。下面就常用的一些内参抗体做一些介绍。

1.GAPDH抗体

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，被广泛地用作Western blot蛋白质标准化的内参。

2. β-Tubulin抗体

Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的zui主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa，其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参，β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照，α-Tubulin和β-Tubulin构成微管蛋白的结构也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

3. Beta-Actin内参抗体

Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了*的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞β-Actin抗体推荐—价的内参抗体内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。

那么如何选择合适的内参抗体呢？内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用需要。推荐的内参要与检测的目的蛋白的分子量相差5KD以上，因此需要根据目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参，例如：GAPDH的检测分子量大约在36kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测30kD-40kD大小目标蛋白的WB实验中；β-Actin的检测分子量大约在42kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测38kD-48kD大小目标蛋白的WB实验中。另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。另外，虽然β-Actin是zui合适的内参抗体之一，但是在某些条件下，一些因素也会导致样品间β-Actin含量的变化，例如在脂肪组织里，β-Actin的表达量非常低，就不适合作为内参。

就一般的蛋白检测来说，β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

以上几条原则只是针对通常情况，但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实际的试验环境并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应综合考虑这方面因素。

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