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MSC人间充质干细胞流式鉴定操作步骤

流程

准备细胞——抗体染色——上机检测

1、准备细胞：取培养的细胞离心（300 g/5min），弃去上清, 加入一定量PBS洗涤一次，弃去上清，弹散细胞，细胞重悬到5×10⁶~10×10⁶之间。

2、MSC人间充质干细胞流式鉴定配色方案：

取100 ml的细胞于EP管或流式管内，分三管染色。

*管 阳性配色 Anti-human CD90 FITC, Anti human CD105 APC，Anti-human CD45 PE-Cy7各加5 ml。

第二管 阴性配色 Anti-human HLA-RA FITC, Anti-human CD34 PE-Cy7, Anti-human CD73 APC各加5 ml。

第三管同型对照 Mouse IgG1 K Isotype Control FITC 0.6 ml，Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7 1.2 ml，Mouse IgG1 Isotype Control APC 1.2 ml。

配色依据：细胞治疗协会间充质和组织干细胞委员会2006年提出了MSC鉴定的zui低标准，关于细胞表型的要求是表达CD90， CD105和CD73不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA-DR；阳性指标都需要染色，阴性指标一般选择2-3个指标，因为是做细胞表型鉴定，所以要配齐同型对照。

3、加入相应的抗体后混匀，建议弹管子，尽量不用枪头直接吹打，室温避光孵育15 min，染色过程中再混匀一次。

4、染色完成后加入1 ml的PBS洗涤细胞，离心300 g/5min。

5、弃去上清，弹散细胞，加入500 ml PBS重悬，上机检测。

注意：1、同型对照是根据染色抗体的用量来计算的，所以每种同型对照可能加入量可能不一样（具体可看后文同型对照章节的介绍）。

   2、先上机检测同型对照管，各检测通道以这一管的信号设为阴性，在上机检测抗体染色管。

   3、zui后结果的显示用峰图来表示，每种抗体的检测结果都与对应的同型对照染色结果叠加展示（ overlay ）。

MSC人间充质干细胞流式鉴定结果

注意：CD90表达量非常高，所以建议用FITC荧光染料，FITC/PE-Cy7/APC这三种荧光染料之间几乎没有补偿，所以这三种染料一起染色不需调节补偿，如果是做脐带干细胞的鉴定，CD105抗体选择SN6克隆号，其他克隆号染色结果不好（某些克隆号染不上）。

MSC人间充质干细胞流式配色抗体

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