小麦粉中过氧化苯甲酰的测定（HPLC/GC）方法

一、容量法
反应原理：过氧化苯甲酰与碘化钾作用，生成碘，碘与定量的硫代硫酸钠标准溶液作用，重新被还原，依据消耗的标准溶液的量计算出过氧化苯甲酰的量。


1、仪器与试剂

1.1微量滴定管（10 ml），滴定管（25 ml）
1.2布氏漏斗
1.3具塞锥形瓶（250 ml）
1.4碘量瓶（250 ml）
1.5重蒸乙醚（分析纯，用前去除过氧化物）
1.5.1过氧化物检验方法：
取5ml乙醚，加1ml　10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物，则放出游离碘，水层呈现黄色；或加入4滴0.5%的淀粉液，水层如呈蓝色，则含有过氧化物，此乙醚需经处理后方可使用。　
1.5.2过氧化物去除方法：无水乙醚重蒸时，在蒸馏瓶中放入纯铁屑少许。弃去10%初馏液和10%残留液。
1.6丙酮（分析纯）
1.7碘化钾溶液（500 g/L，用时现配）
1.8　0.5%淀粉指示液（用时现配）
1.9硫代硫酸钠标准溶液（0.002mol/L）

2、实验步骤：
    平行称到样品2份，每份50.0g于锥形瓶中，加入100ml乙醚和20－40粒玻璃珠（直径约6mm），充分混匀提取（初次提取时，应注意每振荡1、2次放气一次，以避免造成可能的损失）。转移乙醚层于垫着乙醚湿润滤纸的布氏漏斗中，过滤，再分别用50ml乙醚重复提取两次，zui后将内容物倾入上述漏斗，用少量乙醚洗涤锥形瓶，洗液入漏斗中，再用少量乙醚洗涤残渣，转移提取液于碘量瓶中，45℃水浴蒸发乙醚（回收乙醚）至剩约10ml，用氮气吹干后，加入2ml丙酮，振摇1min溶解残渣，加入碘化钾（500 g/L）3ml，盖上塞子，充分摇匀，于暗处放置15min后，加入25mol蒸馏水，加入淀粉指示液1ml，用硫代硫酸钠标准溶液（0.002mol/L）滴定至蓝色消失为终点，同时按上述方法，做面粉空白试验。

二、气相色谱法

1、原理：
　　样品中过氧化苯甲酰经有机溶剂提取后，与碘化钾反应产生苯甲酸，然后用气相色谱法测定苯甲甲酸。

2、试剂和溶液
2.1　100g/L柠檬酸甲醇溶液；
2.2　500g/L碘化钾溶液；
2.3　100g/L硫代硫酸钠溶液；
2.4 甲醇　分析纯；
2.5 乙醚　分析纯；
2.6 丙酮　分析纯；
2.7 氯化钠　分析纯；
2.8 饱和氯化钠溶液；
2.9 无水硫酸钠溶液；
2.10 （1+9）硫酸溶液；
2.11 过氧化苯甲酰标准溶液　称取0.1000g过氧化苯甲酰（纯度>98%），加少量丙酮　溶解，转至100.0ml容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，混匀。取此溶液　10.0ml，转至另一100.0ml容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升含过氧化苯甲酰0.100mg，供作标准曲线用。

　3、仪器

3.1　气相色谱仪　附FID检测器；
3.2　色谱柱　玻璃性（2m×3.2mm）内装60~80目Chromosorb WAW DMCS,涂以5%DEGS+1%磷酸。　

4、操作步骤
4.1样品处理　称取约10.0g面粉，置于100ml具塞试管中，加20~30ml饱和氯化钠溶液，混匀后，加50ml乙醚提取，分取乙醚层于250ml分液漏斗中，重复2次，zui后将内容物倾入垫着乙醚湿润滤纸的漏斗中，滤入分液漏斗中，用少量乙醚洗涤残渣，收集滤液，合并乙醚层（如漏斗下面有水，弃去）。将乙醚转至蒸发器中于约40℃水浴减压浓缩至5ml，加入30ml丙酮，20ml甲醇，1ml柠檬酸甲醇，2ml碘化钾溶液，振摇，于室温放置10min,其间不时摇动，然后将蒸发器于60℃减压浓缩至10ml，用40ml定量转至250ml分液漏斗中，加2ml硫代硫酸钠溶液，振摇，用硫酸溶液调至强酸性，加氯化钠使之饱和。加50ml乙醚提取，水层转至另一250ml分液漏斗中，水层再用50ml乙醚提取2次，合并乙醚层，加10g无水硫酸钠脱水，过滤蒸发瓶中，用少量乙醚洗涤，洗液并入滤液，于40℃减压浓缩至近干，取出，用氮气吹出残余溶剂，准确加入5ml丙酮，供色谱测定。

4.2标准液制备　准确吸取1.0ml，2.5ml，5.0ml，7.5ml，10.0ml过氧化苯甲酰标准溶液，分别置于蒸发瓶中，加入30ml丙酮，以一　4.1从“加20ml甲醇……”起依法操作。此液分别含过氧化苯甲酰20μg/ml， 50μg/ml， 100μg/ml， 150μg/ml，200μg/ml。

4.3　测定　色谱参考条件：μg

柱温：170℃
　　　　进样口、检测器：220℃
　　　　载气：氮气
　　　　调节流速使苯甲酸峰在5min左右出现。
　　　　分别进样5μL标准液中各浓度标准，测定峰高，与浓度比较制定标准曲线，然后进样5μL样品溶液，以峰高在标准曲线上求得过氧化苯甲酰含量，以计算过氧化苯甲酰在面粉中的含量。

　　　
三、液相色谱法
样品经无水乙醇提取，将过氧化苯甲酰还原为苯甲酸，根据HPLC测定苯甲酸的含量推断样品中过氧化苯甲酰的含量。
一、　实验部分
1、　试剂与仪器
1.1　甲醇　分析纯，过0.5μmFH；
1.2　无水乙醇　分析纯，
1.3　0.02 mol/L乙酸铵溶液：　称取乙酸铵1.26g，加水至1000ml过0.45μm滤膜；
1.4　过氧化苯甲酰标准充分调动储备液：　准确称取干燥的过氧化苯甲酰标准品0.1000g，加无水乙醇使之溶解，定容至100ml，此液含过氧化苯甲酰1.0 mg/ml；
1.5　10%柠檬酸溶液；
1.6　50%碘化钾溶液；
1.7 岛津LC－6A液相色谱仪；
1.8 SPD－6A（V）紫外检测器；
1.9 LC－6A溶液输送泵；
1.10 SIL－6A自动进样机；
1.11 C－R3A数据处理机。

二、　色谱条件
色谱柱：岛津CLC－ODSC18（5μm）6.2mm×15cm不锈钢柱；检测波长230nm；灵敏度：0.16AUFS；流动相：甲醇/0.02mol/L乙酸铵（CH3COONH4）12/188；流速：1ml/min，进样量：10μl。

三、测定
取样1.00g于20.00ml试管中，加约5ml无水乙醇，振摇，静置。另准确吸取0.0ml、0.20ml、0.50ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml过氧化苯甲酰标准溶液，分别置于10.00ml比色管中。于样品管和标准系列管中各加2ml50%碘化钾溶液，混匀，放置10min，使其充分反应，用10%柠檬酸溶液调至pH＝5－6，加水定容至刻度，过0.45μm双层滤膜（样品预先用滤纸过滤），进样10μl。以保留时间（Rt＝5.585min）定性，峰高（峰面积）定量。

四、结果与讨论
4.1　定量分析　本法是使过氧化苯甲酰与碘化钾反应，变成苯甲酸而测定的，过氧化苯甲酰不稳定，在室温或加热条件下，易与面粉中还原物质反应，生成物主要是苯甲酸。经过多样测定，天然面粉中不含有苯甲酸。面粉中添加剂过氧化苯甲酰总量应是样品中过氧化苯甲酰与其分解产物――苯甲酸之和，因而样品经直接还原，所测得结果为实际添加过氧化苯甲酰的量。
4.2　pH值的选择　溶液的pH值对柱的寿命有影响pH值小于3或大于8对Rt有影响，并且对柱有侵蚀，故选择pH＝5-6。
4.3　精密度和准确度　以1份面粉添加过氧化苯酰0.05mg/ml做10次平行测定，结果为0.0483±1.42×10－3mg/ml；CV%＝2.9。
4.4　zui低检出限　本法zui低检出量为0.025μg