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免疫组化非特异性染色及控制方法

武汉基因美生物科技有限公司

2011/3/2 11:54:22

                                                          免疫组化非特异性染色及控制方法

一、非特异性染色的识别

常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处,坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性,均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

二、非特异性染色的原因

1. Ig与Fc受体结合

多见于冰冻切片(特别是淋巴造血组织,淋巴细胞,单核细胞,组织细胞表面多),主要是和二抗反应,因为一抗一般稀释度均较大,因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体,所以石蜡切片不多见。

避免方法

(1)用以二抗相同种族的正常血清封闭切片;

(2)用不含Fc段的抗体,但价格贵。(V区,C1区不含Fc段,用Pepsin消化)

2. 静电吸附

抗体是一种带负电荷的球蛋白,容易和带正电荷的组织相结合,如胶原纤维。

避免方法

(1)尽量稀释一抗;

(2)降低抗体的电荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;

(3)用去垢剂如triton-100,Tween-20等处理切片。

3. 二抗与组织中的Ig结合

如羊抗兔的二抗,二抗可以标本中(人)Ig发生交叉反应,科学上越接近的动物,交叉反应越明显,如人与猴,兔与豚鼠。

避免方法:用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。

4. 组织中残存醛基与Ig的结合

如醛类固定后未能*的冲洗,残留醛基可以和Ig结合。

避免方法

(1)*冲洗;

(2)0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗。

一、非特异性染色的识别
常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处,坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性,均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。
二、非特异性染色的原因
1. Ig与Fc受体结合
多见于冰冻切片(特别是淋巴造血组织,淋巴细胞,单核细胞,组织细胞表面多),主要是和二抗反应,因为一抗一般稀释度均较大,因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体,所以石蜡切片不多见。
避免方法:
(1)用以二抗相同种族的正常血清封闭切片;
(2)用不含Fc段的抗体,但价格贵。(V区,C1区不含Fc段,用Pepsin消化)
2. 静电吸附
抗体是一种带负电荷的球蛋白,容易和带正电荷的组织相结合,如胶原纤维。
避免方法:
(1)尽量稀释一抗;
(2)降低抗体的电荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;
(3)用去垢剂如triton-100,Tween-20等处理切片。
3. 二抗与组织中的Ig结合
羊抗兔的二抗,二抗可以标本中(人)Ig发生交叉反应,科学上越接近的动物,交叉反应越明显,如人与猴,兔与豚鼠。
避免方法:用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。
4. 组织中残存醛基与Ig的结合
如醛类固定后未能*的冲洗,残留醛基可以和Ig结合。
避免方法:
(1)*冲洗;
(2)0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗。
 
5. 内源性过氧化物酶
红细胞,粒细胞的含量尤其高,镜下可以识别,不要将其当成阳性结果。
避免方法:
(1)石蜡切片 0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片;
(2)冰冻切片 3%双氧水处理切片5分钟(99:1)因为未经固定包埋,大部分酶未被破坏;
(3)对于骨髓涂片 用非过氧化物酶标记的抗体
6. 内源性生物素
以 24mg/ml的卵白素封片15分钟。
7. 交叉反应
PcAb敏感性高,但特异性稍低,容易出现非特异性染色。
避免方法:
(1)尽可能稀释抗体;
(2)尽可能用McAb。
 
 

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