支原体快速检测试剂盒（细胞培养）

《Quick Cell快速支原体检测试剂盒》主要用于检测细胞培养上清或别的液体样品（如血清）中是否含有支原体污染，该试剂盒仅用于基础科研。

哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至*错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。本试剂盒可以检测：（1）M.Hyorhinis、（2）M.Fermentans、（3）M.Arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）Acholeplasma Laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M.bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis等几乎所有常见的污染细胞的支原体（注：M.为Mycoplasma的缩写）。以上13种支原体约占细胞支原体污染的99%以上，本试剂盒产品全部可以检测。绝大多数支原体污染集中于前8种。注意：本试剂盒无法检测Ureaplasma Urealyticum支原体！Ureaplasma Urealyticum在支原体污染种极其罕见。

与PCR法检测支原体比较，本试剂盒产品优势优势显著：

试剂盒组成

（1）溶液Ⅰ：1150 μL （50次检测）

（2）溶液Ⅱ：50 μL（50次检测）

（3）溶液Ⅲ：指示剂，50 μL（50次检测）

（4）阳性支原体DNA：50 μL

（5）矿物油：1500 μL

使用方法

1. 待测样品的准备：为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品来源于至少培养三天且汇合度在70-90%左右的细胞培养上清（贴壁细胞），无需离心。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，至少让细胞生长3天再取培养液进行检测，也无需离心。哺乳动物细胞的存在不会影响检测结果。

注：收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测，请放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月，在-80℃可以长期保存。此外，为了节约检测成本，可以将不同时间收集的样品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起检测。

2. 反应体系的配制

表1：恒温反应体系的配制

（1）将溶液Ⅰ、溶液Ⅲ从-20℃冰箱中取出，待其融化后（可在37 ℃ 水浴内放置5-10分钟以帮助融化），从-20℃冰箱中取出溶液Ⅱ置于冰上。吹吸均匀后，按表1比例，混合溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ。如有多个样品，为了防止移液误差，建议溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ用量乘以系数1.08，保证每个反应管中的反应液足量。从配液开始的所有步骤，均在冰上操作。

举例：如果待测样品为3个（加上1个阴性和1个阳性对照），则样品总数为5个。溶液Ⅰ的总体积为23×5×1.08=124.2μL，溶液Ⅱ的总体积为1×5×1.08=5.4μL，溶液Ⅲ的总体积为0.18×5×1.08=0.972 μL将溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合均匀。

注：溶液Ⅱ必须一直在-20 ℃冰箱中保存，并在操作时置于冰上。溶液Ⅱ即使在-20 ℃条件下仍为液态，不需置于室温。

（2）将上述配制好的反应体系，吹打均匀后，按每管24 μL分装到0.2 mL的PCR管中。尽量保证每管的反应液体积一样。 PCR管应该使用透明度良好的薄壁PCR管。

（3）往测试管（Test）中加入1μL待测细胞培养液；往阳性对照管（Positive）中加入1 μL阳性支原体DNA；往阴性对照管（Negative）中加入1μL灭菌水；反应液的总体积为25 μL。

注1：装有阳性支原体DNA的螺口管开盖之前，用力甩一下，或者用迷你离心机即可。

注2：进行反应体系配制的房间，与进行样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间分开。

3. 反应

PCR仪设置程序：61℃，60 min；10℃, forever；热盖温度，100 ℃。

注意：若实验室反应场所没有PCR仪，可用水浴锅代替，水浴锅显示温度与实际温度的温差不超过0.5℃，另须往每个反应管内加入25μL矿物油，以防止水份挥发，然后盖上盖子，将反应管插入带孔的漂板内，放入已经升温到61℃的水浴内，准确反应60分钟。

4. 结果判断

61℃反应60分钟后，立刻取出反应管，放于室温。以一张白纸或白色泡沫盒为背景，通过反应管溶液颜色的变化，即可判断检测结果。如果溶液为蓝绿色，则说明有支原体污染；如果为紫红色，则说明没有支原体污染（如图1）。

注：在61℃反应的时间必须准确计时，zui多不得超过5分钟，以免出现假阳性。必须在反应后2小时内进行结果判断，避免室温下扩增反应进行，影响结果判别。