简介
在室温下分子大都处在基态的zui低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到*电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到*电子激发态的zui低振动能级，能量的这种转移形式，称为*跃迁。再由*电子激发态的zui低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
图 1. 荧光机理（Jablonski 图）荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。物质吸收的光，称为激发光。物质所发射的光，称为发射光或荧光。如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光强度所得到的光谱，被称为该荧光物质的激发光谱。选取激发光谱中zui大吸收峰处的波长，固定波长检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱。激发和发射光谱是荧光物质定性的依据。对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。为获得*数据，仪器参数的设定尤其重要。在本技术指南中，对Lumina仪器参数的含义进行说明，同时说明设定值变更和荧光光谱变化之间的相关性。
仪器参数
PMT：光电倍增管电压，可增加荧光强度。PMT的设定值越高，荧光强度就越高，不过噪声信号也会增加；因此，可根据样品适当调整。狭缝：可调整光束宽度，光束宽度越宽，到达样品的光束越多，荧光强度也会增加。发射波长间隔：检测样品时，可设定波长间隔。如设定为0.1nm，光束的照射密度会很密，会使检测时间变长。积分时间：检测样品时按照波长间隔向样品照射光束的时间。假设在400～600nm范围内进行发射扫描，积分时间为20ms，如将间隔设为0.1nm，荧光检测步骤如下：400nm波长下，照射20ms；400.1nm波长下，照射20ms；400.2nm波长下，照射20ms。也就是说，随着积分时间的增加，在各波长下照射光束的时间也会增加，使得扫描速率 (nm/min) 变慢，荧光强度增加。
标准样品：
•荧光素 (3×10-6 M)
上述参数可根据样品进行调整。
图 2. 荧光素的分子结构
•蒽 (1×10-5 M)
图 2. 荧光素的分子结构
2.Lumina荧光分光计
3.Luminous软件
4.荧光比色皿（光程 10 mm）
实验步骤
按照*的仪表参数对标准样品（荧光素、蒽）进行检测后，边更改仪表参数设定，边确认荧光光谱的变化。
1.检测标准样品的激发、发射光谱
2.检测不同PMT值下的发射光谱荧光强度变化
3.检测不同狭缝值下的发射光谱荧光强度变化
4.检测不同积分时间值下的发射光谱荧光强度和扫描速率变化
5.检测不同发射波长间隔对扫描速率和荧光光谱的影响
6.检测不同扫描速率对光谱的影响
7.检测不同响应时间对光谱的影响
结果
1.标准样品的激发、发射光谱
图4为按照图5所示仪表参数进行检测的荧光素激发、发射光谱。
图 4. 荧光素 3×10-6 M 的激发光谱（红色）和发射光谱（黑色）
图 5. 仪器参数设置
2.不同PMT 值对发射光谱的影响
如图6所示，随着荧光素PMT电压的增加，荧光强度会增加。
图7为不同狭缝宽度下荧光强度的变化。通过狭缝宽度的变更，可调整激发光和放射光的量。通过实验可以看出变更狭缝宽度对荧光强度的影响大于变更PMT值对荧光强度的影响。e="宋体" >电压的增加，荧光强度会增加。
图 7.不同狭缝宽度对荧光强度的影响
4.不同积分时间对发射光谱及扫描速度的影响增加积分时间，即增加光束照射样品的时间，发射光强度会增加，还可确认荧光扫描速率也会发生变化。
图 8. 不同积分时间下的荧光强度及扫描速率值的变化
5.不同发射波长间隔下发射光谱的变化Lumina的荧光光谱扫描速度设置为用户自定义时，积分时间、平均数、扫描间隔可以按照自己的意愿进行设定。增加发射波长间隔时，检测间隔会增加，故扫描速率会加快。当扫描速率加快时，如图9所示，光谱 FWHM 变宽。
图9. 不同发射波长间隔时对荧光强度及扫描速率值影响
6.不同扫描速率对发射光谱的影响其他参数不变的情况下，随着扫描速率的加快，光谱FWHM变宽。
总结
仪表参数的设定会对光谱数据产生巨大的影响。根据样品类型、浓度及纯度，仪表参数的设定值应会有所不同，检测员需根据样品类型和状态，变更仪表参数的设定值，以求获得*的光谱条件。erun:'yes';font-family:'Times New Roman';" > 其他参数不变的情况下，随着扫描速率的加快，光谱FWHM变宽。
