简介
在生物化学领域中，生物材料的热学性能研究是材料分析的重要组成部分。而熔解温度（TM）是生物材料中应用zui广泛的热学性能。生物材料由许多化学键组成，随着温度的升高，材料内能增加同时化学键断裂。这种因化学键断裂而导致生物材料结构改变的现象被称作热变性。此外，zui活跃时的变性温度被称为熔解温度。熔解温度是用于表征材料稳定性的指标之一。寡核苷酸是一种遗传物质，由多组碱基构成。寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光杂交等过程中。如图1所示，我们将Alexa Fluor® 488 荧光探针标记在寡核苷酸的5´ 端部，将Alexa Fluor® 532 荧光探针连接在另一端。
本实验采用Thermo Fisher公司的lumina荧光分光光度计配备 Peltier 温控系统（图2）对不同温度下的荧光性能进行了测量。Peltier温控系统可快速地对温度进行调节，温度范围可控制在-10℃到100℃。该系统有样品除霜功能、磁力搅拌功能和温控功能。本研究采用 Lumina 和 Peltier系统，结合荧光标记，研究了寡核苷酸荧光强度与温度的关系。zui终根据一阶导数分析熔点曲线并计算出了TM 值。
图 2：Peltier 系统配件（单池池架（a）、4 联池池架（b）、Peltier 控制模块（c））
试剂和仪器
1.Lumina荧光分光光度计
2.Peltier 控制模块、单池池架
3.供体寡核苷酸5´ – (Alexa 488) – ACCGTGAGCA – 3´
4.受体寡核苷酸
5´ – (Alexa 532) – TGCTCACGGT – 3´ 5.Tris-EDTA 缓冲液（pH 8.0）
6.NaCl（ACS 试剂，≥99.0%）
7.10ml 塑料管
8.荧光比色皿
实验步骤
1.添加 10ml 的 Tris-EDTA 缓冲液（pH 8.0）到两根塑料管中，形成浓度分别为172mM（供体）190mM（受体）的NaCl溶液。
2.在上述缓冲液中溶解供体/受体寡核苷酸，使浓度变为900nM。
3.混合已制备的供体试剂和受体试剂，然后在室温下培养5分钟。
4.将Peltier系统安装在 Lumina上。5.打开Luminous的Thermal软件，如图3输入预定参数。使用软件（Excel®, Origin®等）根据供体各测量点数据计算一阶导数，并在测量后查看TM 值。
仪器参数
图3：Thermal软件测量条件
实验结果
FRET 现象是供体到受体的一种能量转移现象，这是由于荧光物质受热前荧光探针间距离较短造成的。因
此，在供体激发波长519nm处发出较弱的荧光，在受体的激发波长553nm处发出较强的荧光。另一方面，
随着受热产生的热变性现象，与FRET现象相反。换句话说，荧光在519nm时较强，而在553nm时较弱（图4）。
图4：受热前（左图，25℃）、受热后（右图，55℃）热变性荧光强度如图5所示，我们绘制了供体、受体荧光强度与温度的关系。可以确认，供体和受体上发生的荧光强度逆转的情况是由于 FRET 现象消失导致的。
图5：供体、受体荧光强度与温度的关系
目前有多种方法可以确定TM 值，本实验中我们通过一阶导数的峰值来确定TM 值。本次试验所用寡核苷酸的TM 值为49℃。（图6）
图6：荧光强度随温度而改变
实验结论
本研究中，使用Thermo Fisher公司Lumina荧光分光光度计和Peltier 温控系统，研究了温度变化对寡核苷酸荧光强度的影响。此外，根据实验数据计算出代表材料安全性的TM 值。
