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2018/1/19 10:38:17fff简介分子之间的能量转移大多是由辐射导致的。然而当不同荧光物质非常靠近时(<10nm),会发生共振能量转移(RET)。荧光共振能量转移(FRET)是一种的型的 RET现象。
图1 所示在 FRET 中,使用强光照射以激发供体能量,处于激发态的供体将一部分或全部能量转移给
受体,受体被激发。如果受体荧光量子产率为零,则发生能量转移荧光熄灭;如果受体也是一种荧光发射
体,则呈现出受体的荧光。光照下很多荧光物质会逐渐失去其荧光特性,这种现象被称为光漂白。为了提高灵敏度,近期生物发光共振能量转移(BRET)得到了广泛应用1。BRET使用生物发光物质代替了荧光供体。由于BRET不在需要直射光线以激发供体,不存在放射性的能量转移,所以避免了对样品的损害(如图2)。荧光素酶是一种萤火虫体内的生物发光酶,被广泛用于 BRET研究2。本实验中,选择Luc8(海肾荧光
素酶)作为供体(图3),该物质由海肾(Renillareinformis)基因突变而来。如图4所示,Luc8 的生物
荧光峰值接近480nm。
图2:BRET示意图
图 3:海肾(左)和Luc8蛋白结构(右)
图 4:Luc8的发射光谱右)
本实验中,使用了四种类型的量子点(605、655、705和800):它们具有高量子产率,并适用于多种荧光波长(图5)。这些量子点在较大的波长范围内都有吸收,但是在605、655、705和800nm时发出的荧光较强。
图 5:量子点的结构(左)和荧光(右)
发光强度相对于强光直射产生的荧光强度较弱,同时使用微量比色皿获得的光量较小。为了在测量 BRET时能够更加地收集光,本实验使用了发光微量池支架,该配件可zui大程度减少微量池与发射透镜之间的距离(图6)。
试剂和仪器
1.Lumina荧光分光光度计
2.发光微量池支架
3.PBS缓冲液0.1M(pH 7.4)
4.Luc8 150 M
5.量子点605、655、705、800 8 M(Invitrogen)
6.腔肠素H 1 g/ l 甲醇溶液(Promega)
7.NiCl2 100 M 蒸馏水溶液(Sigma Aldrich)
8.10 l 微量离心管
9.45 l 荧光微量池
10.吸液管和吸液头
11.涡旋混合器
实验步骤
1.准备4个10 l 微量离心管。
2.在每个离心管内填充94 l PBS 缓冲液和 1 l Luc8(供体)。
3.在每个离心管中添加5 l量子点605、655、705、800(受体)。
4.在每个离心管中注入2 l NiCl2溶液(供体和受体之间的结合试剂),并在充分混合。
5.将发光微量池支架安装到Lumina上,注入样品并插到支架上。
6.打开Luminous WaveScan 软件,输入设定参数,点51击应用(Apply)(图7)。
7.使用吸液管注入2 l腔肠素H,迅速合拢测试舱盖,点击开始按钮。
8.应用基线校正功能对测得的光谱进行校正。单击基线校正(Baseline Correction)图标,使用具有zui低生物发光强度的波长进行基线校正(图8)。
9.根据Luc8峰值对光谱进行标准化校正,比较量子点峰值。为了标准化,计算各个转换标量,使得所有Luc8峰值强度相等。然后单击标量计算器(Scalar Calculator)图标,通过乘以转换标量对其进行标准化转换(图9)。
仪器参数
图 7:波长扫描测量条件
图 8:基线校正窗口
实验结果
从测得的光谱上,可以观察到BRET现象,Luc8与各量子点发生了生物发光能量转移(图10)。由于多重量子点结合可在单个波长条件下产生多种波长,因此使用量子点的BRET对分子诊断和成像领域均有很大助。BRET 能量转移的效率的因素有:(1)供体和受体之间的间隔距离;(2)供体发射和受体激发光谱的重叠。通过比较使用Luc8峰值进行标准化校正的光谱,我们可以证实量子点665-Luc8结合物在多个结合物中产生的BRET效率zui高。
实验结论
Thermo Fisher公司的Lumina荧光分光光度计和发光微量池架配件有助于检查BRET,其产生的噪音要小于FRET。此外,实验证明根据量子点发射波长的不同,BRET现象可应用于较广的波长范围。