双向电泳样品制备程序

一、培养细胞（culture cell）样品处理方法：

培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：

1. 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10.

其他常用的裂解缓冲液如下：

2. 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10,1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;

3. 加入 0.3-1% SDS 在 95 C 煮样品 5mins，冷却后加入至少 5倍体积的（A）或（B）裂解液。

总蛋白抽提程序：

1. 培养细胞的收集；

2. 用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞 3 次（室温，1000g，各 2min）；

3. 将细胞分装到 1.5ml Eppendof管中，吸干残留的 PBS；

5. 4 C，40,000g，离心 1h；

6. 吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里保存在-78℃备用。

二、组织样品处理方法：

对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。

三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：

1. 在液氮中研碎叶片；

2.  悬浮于含 10％三氯醋酸（TCA）和 0.07%β-巯基乙醇(可用 DTT替代)的丙酮溶液在－20℃  的冰浴；

3. 让蛋白质沉淀过夜然后离心（4 C，40,000g, 1h），弃上清；

4. 重悬沉淀浮于含 0.07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；

5. 离心（4 C，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；

6. 用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4 C，40,000g, 1h）。

7. Brandford 法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里保存在-78℃备用。

超速离心法：

1. 取材；

2. 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s；

3. 组织悬液15℃，10 000× g离心10 min；

4. 上清液4℃，150 000× g超速离心45 min；

5. 小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40,000g再次离心50 min；

6. 取离心上清。Bradford法定量，分装后置-75℃保存。