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甲基化特异性PCR

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2018/7/19 11:16:59

甲基化特异性PCR

标签: 甲基化 特异性 PCR

DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯yi存在的化学性修饰碱基。

实验方法原理MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因 组DNA,未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳,凝胶扫描观察分析结果。
实验材料

DNA

试剂、试剂盒

亚硫酸氢钠、氢醌、石蜡油、乙醇

仪器、耗材

水浴锅、PCR仪

实验步骤

1.  在50 μl 体系中,DNA(2~5 μg)经NaOH(终浓度值0.2 mol/L)在37℃变性10 Min。

2.  对于ng级别的人基因组DNA,在进行修饰前加入2μg蛙鱼精DNA为载体。


3.  加入30 μl 刚配制好的10 mmo/L 氢醌与520/1的40.5%亚硫酸氢钠混匀。

4.  然后用石蜡油隔绝空气的条件下,避光在50%温育16 h。


5.  修饰后的DNA过WizerdDNA纯化柱,用50/1 L 水洗脱。

6.  室温下用NaOH(终浓度为0.3 mol/L)修饰5 min,之后用乙醇沉淀。


7.  DNA溶于20 μl 水中,立即使用或在-20℃保存。

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