PCR仪

　　介绍

　　何谓PCR 简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 In Vitro 的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。

　　PCR的要素

　　基本的PCR须具备

　　１.要被复制的DNA模板 Template

　　２.界定复制范围两端的引物Primers.

　　３.DNA聚合酶 Taq. Polymearse

　　4.合成的原料（四种脱氧核苷酸）及水。

　　PCR的反应包括三个主要步骤：分别是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。所谓 Denaturing乃是将DNA加热（至90~95℃）变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下（冷却至55~60℃）附着于模板DNA两端。 zui后在DNA聚合酶 e.g. Taq-polymerase 的作用下（加热至70~75℃）进行引物的延长 Extension of primers及另一股的合成。

　　PCR的zui早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年zui早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

　　PCR的实现

　　1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

　　PCR的改进与完善　

　　Mulliszui初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片

　　段，其缺点是：

　　①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。

　　②引物链延

　　伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的

　　DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，

　　但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成

　　一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引

　　起生物医学界的足够重视。

　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较

　　高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种

　　耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的

　　90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40

　　%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异

　　性和扩增效率，增加了扩增长度2.0Kb。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也

　　大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA

　　Polymerase。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

　　获得诺贝尔奖的PCR技术

　　1995年，美国科学家Mulis众望所归地获得了诺贝尔化学奖，他所取得的成就是发明了PCR技术。

　　PCR，中文译为聚合酶链式反应，其实是一种DNA的快速扩增技术，其扩增效率之高就象核裂变的“链式反应”那样。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热的酶的作用，可以在3个小时内把特定的DNA量提高1000万倍。这种技术一问世，立刻引起了分子生物学研究的一场革命，人们利用这种轰动*的技术很快就把微观领域的生物学研究大大地往前推了一步。可以这么说，PCR技术使分子生物学研究一下子获得了突破，而且随着PCR技术的日趋完善，PCR在人类社会生活中的应用也越来越广泛。比如说在“DNA指纹”中我们提到，科学家们只需要一根头发甚至一个细胞就可以完成DNA指纹的鉴定工作，这里实际上就要采用PCR技术，因为一个细胞中的DNA含量实在太少了，人们根本不可能检测到它的指纹；有了PCR技术就好办了，通过PCR技术把这个细胞中的DNA片断扩增1000万倍，这样DNA量就足够作指纹鉴定了。再比如，在医院里检验血液中的某种病毒，有时病毒量极少（例如有的艾滋病病毒携带者），通过传统的检查方法费力又费时，这时PCR技术也许就可以帮上忙。可以先选定这种病毒DNA上的一段DNA，设计合适的引物DNA，然后通过PCR技术一扩增很快就可以判断出血样中是否扩增出了大量的DNA，如果是的话，那么就说明血样中带有该种病毒了。PCR方法不但有*的灵敏度，而且可以同时一次做近百个扩增反应，省时省力效率高。

　　PCR技术神奇就神奇在以下几个特点上：一是被扩增的DNA所需量极小，理论上讲一个分子就可以用于扩增了；二是扩增效率高，目的基因的量成指数形式扩增，几个小时就扩增1000万倍以上。现在PCR技术已经被广泛地应用于生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监测等诸多方面，真不愧是“获得诺贝尔奖”的好技术！

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