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DNA合成仪 功能 原理 使用方法 日常维护 基本结构

苏州亚凡生物技术有限公司

2011/4/1 10:56:58

DNA合成仪

 

  
DNA合成仪

设计用于合成结构上类似DNA或RNA的寡核苷酸的自动化仪器。一般应用于固相合成法，每次将一个核苷酸加到所接长的寡核苷酸链上，加入每一个核苷酸都利用相同的化学反应与相应的嘌呤或嘧啶碱基衍生物作用。所用化学反应和操作细节随不同的仪器而改变，zui广泛应用的方法是DNA合成的磷酸酰胺法。

 

 

 

功能及原理

 

基本组成结构和性能

（一）压力系统

　　系统压力由超纯氩（99．998％）提供。氩气密度高、氧污染少，因此高压氩气常常用来启动真空辅助系统及供给合成仪调节器。进入合成仪的氩气通过10txm的颗粒过滤器后送到3个压力调节器，调节器将氩气输送到特定的压力阀来增加试剂和溶剂瓶的压力。调节器也将氩气供给柱子和试剂阀体。

（二）试剂和溶剂储液瓶

　　仪器上每个储液瓶都有特定的位置，储液瓶盖座和仪器上所有号码相对应，仪器上的位置或储液瓶的编号都是1—8（5个碱基的仪器为1～5）、9、10、11、12、14、15、18和19（配有自动分析的仪器）。将1～8号瓶向上推，在聚四氟乙烯插塞周围有一“O”形环，每一瓶颈内部形成一气密塞。因为试剂输送系统是要加压的，所以要使瓶
 
　　子与仪器之间的密封塞保持气密性。选择合适的一次性塞及在瓶上加“O”形环可以加强气密性。

（三）压力管路及输送管路

　　每个瓶子都有一个氩气压力管道及输送管道进入瓶盖插塞，对于亚磷酰胺，1—8号瓶其压力管道也作为排气管。氩气管要保持在液体水平以上，而输送管却伸到瓶的底部。当阀门正确设置打开时，储液瓶上部空间由氩气加压，液体被推进输送管，流到其目的地。

（四）亚磷酰胺瓶排气

　　除了加压外，亚磷酰胺瓶都是用压力排气管排气的。把亚磷酰胺放人仪器前，要用氩气排除空气使其净化。净化是通过输送管输送气体，当气体输送到瓶内时，空气经压力排气管排出。这是由瓶子更换步骤自动完成的。废液瓶是输送系统的低压侧，必须将出口与大气相通。要确保排气管通到通风柜。如果排气管阻塞，将会产生反压，试剂和溶剂的输送会受到抑制。

（五）输送阀块

　　试剂输送系统包括两个试剂阀块（8碱基仪器有3个）及2个或4个柱阀块。阀块控制气体和化学试剂流人柱子及出口。除亚磷酰胺和四唑以外，试剂和溶剂都被同时输送到所有活化柱。当有多个活化柱时，对流速的细微变化，以自动调节每个柱子的输送次数来补偿。每一个5—端口柱阀块将流出物导人废液口、DMT收集口，或DNA收集瓶，它也控制用于除去或冲洗柱内和柱阀块内的试剂的氩气。

（六）辅助真空

　　对于阀块的适当运行，关键是隔膜形成一个圆顶小空隙，每次电磁阀打开时，抽气泵为每个阀块提供了辅助真空，辅助真空在隔膜的螺线管一侧形成，使隔膜形成一圆顶空隙。

（七）柱子

　　起始结合在载体上的核苷酸是装在一次性的柱子中，除柱体外，还有2个固定过滤板和2个接头，所有的部件都由惰性材料制成。固定过滤板是多孑L性聚苯乙烯固定在两端盖子中。人口和出口都是母路厄氏（1uer）接头，与仪器的公路厄氏接头配对。柱子是对称的（没有顶端和底部、前后之分），可以以任何方式与公路厄氏接头相连接。每一个柱子都用颜色编号，表示不同的起始核苷酸，以及有一个*的连续顺序号码。正常的流路是从底部进入，通过向上输送液体，使CPG颗粒上升并保持悬浮状态。溶剂和试剂的流速已经设置好，能使颗粒适当地混合。

（八）路节流阀

　　试剂通过底部的luer接头，流到柱子，如果没拧上下面的一个luer接头，应会在一个圆柱形的玻璃流路节流阀上发现。试剂通过流路节流阀中一个很小的通道流到柱子。小量的试剂可以在流路节流阀中结晶，长期这样会造成流路阻塞。

（九）废液和排气

　　大多数化学试剂输送的zui终点是废液瓶，废液瓶是一个空立着的10L的聚苯乙烯容器，可放在合成仪附近的地板上或放在低于仪器的附近工作台上。排气管将废气导人适当的排气装置，如排烟罩

（十）电导池

　　电导流动池是为了测定在每个DNA合成循环内释放的DMT阳离子的总电导而设计的。流动池是由一空隙隔开的两个电极组成，在空隙之间应用一小电压。DMT阳离子流过电导池时起电导作用。

（十一）电池

　　DNA合成仪一般带有锂电池，可以使用几年。当主电源断开时，所有的合成参数都被保留下来。这些参数包括储存的DNA序列，用户设定的循环、步骤和功能，以及瓶子使用资料等。如果正在合成中电源出现故障，合成将被中断，只有主电源恢复时合成才可重新开始。电池还保持合成仪内部的时钟计时。

（十二）控制器

　　控制器指导和初始合成仪的所有活动，它的主要部分是软件、微处理机、显示屏幕、键板及相关的电子部件。软件控制合成的所有必要操作并由微处理机来解释和执行。软件储存在一个可取出的存储卡中，这个存储卡插在仪器的背面。合成信息显示在液晶显示屏上，通过选择键板上的键可与仪器交流。软件是“菜单驱动”，通过按适当的键，可选择一项，给予指令。为了完成自动合成，软件应用一个包含一系列步骤的循环来完成全部化学反应。
 

使用方法操作步骤

　　以亚磷酰胺寡核苷酸合成为例介绍该类仪器的一般操作步骤。亚磷酰胺DNA合成的试剂有：保护碱基的5／—DMT，A、G、C、T亚磷酰胺单体，四唑偶联催化剂，乙酐，N—甲基咪唑封闭试剂，三氯乙酸（TCA）脱保护溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶剂，氨水切除溶液。使用步骤如下：
 
　　1）仔细检查合成仪上所有试剂瓶中的试剂量，必要时换掉试剂瓶，特别注意乙腈的量，因为该溶剂用量较大。
 
　　2）将标记好的清洁的收集瓶装在合成仪上。
 
　　3）将要合成的DNA序列输入合成仪。
 
　　4）检查选择的合成步骤是否正确。
 
　　5）选择结束方法：TritylOffAuto是仪器的原始状态，若打算以5，—DMT基团连接纯化寡核苷酸，将其转变为TritylOnAuto结束状态。
 
　　6）选择结束方法，一般为系统的原始状态。
 
　　7）在每个柱监视器的Username下，输入你所希望的保存名字。
 
　　8）以代码代替相应的DNA序列标记每一个收集瓶。
 
　　9）打印出每一个柱设置的详细资料。
 
　　10）检查打印出来的资料是否正确。
 
　　11）运行StartColumn步骤检查每一个柱的位置，确保合成仪上合成柱处于正确的位置。
 
　　12）检查连接在合成仪上的溶剂残留（废液瓶）是否充满。
 
　　13）如果分部收集器用来收集每个DMT脱保护步骤的流出物，确保试管充分清洁干净，并打开分部收集器，确保DMT废液管路通向分部收集器。
 
　　14）启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。
 
　　注意：TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，并将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个DMT，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中；TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中。
 

日常维护

　　1．瓶塞“O”形环
 
　　一月检查一次“O”形环，zui少1年更换1次。将新的备用“O”形环与仪器上的相比较，如果在“O”形环上出现白色沉淀，用棉花蘸取乙腈，进行清洗。更换“O”形环的步骤如下：用止血钳夹住“O”形环，从槽中取下（或用牙签钩下），注意不要损坏托住“O”形环的白色聚氟乙烯插塞（tefloninsert）；确保插塞上没有颗粒后，用手指将新“O”形环推进槽，进行压力实验。
 
　　2．储液瓶
 
　　瓶子都要放在亚磷酰胺及储液瓶位置上，并保持氩气压力以及管路清洁。
 
　　3．流路节流阀
 
　　为了防止阻塞，节流阀应该1个月清洗1次，清洗时，先在水中煮沸15min，然后再在甲醇中超声波清洗。
 

不同型号DNA/RNA合成仪的特点与性能简介

　　PE公司391型DNA／RNA合成仪
 
　　美国PE公司应用生物系统部（原美国应用生物系统公司，ABl）于1982年推出了世界上*台全自动DNA合成仪。391型DNA／RNA合成仪可满足不同科研工作者对高产率、高纯度DNA、RNA的需求。该仪器采用固相亚磷酰胺合成法，配有多种规格合成柱，可满合成大量的长片段DNA；合成试剂纯度>99.8％；每步偶联效率>98．5％，保证一般情况下可合成100bp以上核酸片段，而且合成的片段纯度高、产率高；每步循环时间5—6min，合成时间短；可以合成混合引物或探针，即保证在引物某一位点各种碱基有同等掺人率；引物可使用寡聚核苷酸纯化柱纯化；采用快速脱保护试剂，可在1h内完成碱基脱保护。
 
　　美国贝克曼公司01ig01000系列DNA合成仪
 
　　Olig01000系列采用星型射流设计，可节省试剂用量达50％；可自由选择30、200和1000nmol合成量；每个循环只需2min，裂解／脱保护步骤所需时间短，可在1h内合成约17个碱基的引物；碱基试剂采用防潮双元包装，能迅速无误稀释核苷酸，具有良好的偶联效率；仪器配有自动监控系统，保证DNA准确合成；合成产物纯度较高，无需纯化，可直接应用于大多数的研究。
 
　　现在国内比较常见的高通量DNA合成仪是ABI3900，MM192和OLIGO192，前者一次可合成48条，后二者一次可以合成192条。
 

发展

　　当前DNA合成仪的主要生产厂商都致力于机器性能的完善和应用领域的开拓以及率、高产率的仪器的开发与研究。
 
　　中国台湾科学委员会“基因医药卫生科技研究计划”中的基因生物技术组已经成功研发**台高密度复制DNA合成仪，可以同时合成384条不同DNA，每日可合成768条DNA，并可以配合聚合酶连锁反应装置，大量复制各种基因，不但节省时间，也可节省大量人力，这部机器能复制动物、人体、植物的基因甚至是防伪基因。
 
　　由于人们所需要的大部分核酸的碱基对数量远远超过目前DNA合成仪可以合成的zui长核酸链的碱基对数量，因此还需要不断改善合成工艺才能得到较长的核酸分子。
 
　　为了能够在将来改变酶的结构，使其在工业上更有价值；改变蛋白质和多肽的结构，制备新药物；并开拓有关人类疾病和遗传调控的新领域，化学合成DNA在这一过程中将起关键性作用。根据不同化学方法研制的DNA合成仪也将不断涌现，能够突破现有核酸合成的碱基对数量限制，大量节省人力、物力、财力。

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