一、工作原理
分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其*的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。
分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。
根据Lambert-Beer定律说明光的吸收与吸收层厚度成正比，比耳定律说明光的吸收与溶液浓度成正比；如果同时考虑吸收层厚度和溶液浓度对光吸收率的影响，即得朗伯-比耳定律。即A=εbc，(A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度，c为溶液浓度)就可以对溶液进行定量分析。
将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应*一致。如果没有标样，也可以和现成的标准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。
实验证明，不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同，这可以利用紫外光谱来判断化合物在不同溶剂中氢键强度，以确定选择哪一种溶剂。
二、紫外可见分光光度计的工作环境
1）分光光度计安放在干燥的房间内，使用温度为5-35℃，相对湿度不超过85%
2）仪器应放置在坚固平稳的工作台上，且避免强烈的震动或持续的震动
3）室内照明不宜太强，且应避免直射日光的照射
4）电扇不宜直接向仪器吹风，以防止光源灯因发光不稳定而影响仪器的正常使用
5）尽量远离高强度的磁场、电场及发生高频波的电气设备
6）避免在有硫化氢等腐蚀性气体的场所使用
二、减除紫外可见分光光度计因素误差的措施
1、减除入射光束单色性不纯的影响
各种不同的分光光度分析仪器除了本身的质量决定其单色光的纯度不同外，使用或操作也会影响单色光的纯度，例如对同一台分光光度计，由于出射狭缝调节不当就会使单色光纯度差。因此除了应该根据分析的要求选择适当的仪器外，还必须正确的使用仪器。
2、减除杂散光的影响
杂散光的主要来源是仪器的光学元件保护不好，例如透镜或反射镜上有尘埃或指纹印。分光光度计光学系统的暗箱中的黑体被划伤或脱落，在操作时样品室盖未盖好等。因此要消除杂散光应注意以下几点。
1）做好分光光度计（特别是光学系统）的防潮和防霉工作。不允许用手或其他硬物摸碰光学元件和暗箱的黑体
2）保护好吸收池架，并应经常保持其清洁和干燥
3）测定时，必须盖好样品室盖
3、减除吸收池误差
吸收池的质量（主要是精度）不好或使用不当都会给测定结果带来误差。即使是同一组的数个同规格的吸收池，也不能保证其光程长度相等，只是其误差在一定的范围之内。为了减除由此而产生的误差，使用时应对吸收池进行校正。
