技术文章

摘要研究了以辣根过氧化物酶
-苯酚
-4-氨基安替比林反应显色新体系，检测黄嘌呤氧化酶（XOD）活力的
新方法。确定该酶活性测定的*条件为：辣根过氧化物酶（
HRP）7000 U /L，4-氨基安替比林（
AAP）
1 mmol / L，苯酚（PA）6 mmol / L，黄嘌呤（XAN）1 mmol / L溶于
50 mmol / L Tris-CL缓冲液（pH 8.4）；反应温度
为
37℃，保温时间为
20 min；检测波长为
508 nm。本方法测定
XOD酶活的线性范围为5.0～100.0 U /L，线性
关系良好（r
= 0. 9992），检出限为
1.3 U /L。该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。可有效应用于普通实
验室和临床常规生化检测。

关键词黄嘌呤氧化酶，辣根过氧化物酶，酶的活力测定，分光光度法

1引言

黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD，EC1. 2. 3. 22）是一种钼羟类胞质缀合酶。主要用于痛风、
心肌梗塞和细胞损伤后次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测［1～3］。目前测定黄嘌呤氧化酶活力主要采用
NBT / MTS-PMS比色法、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法［4～8］等方法。但比色法形成的显色物
溶解度低，
PMS对
XOD活性有一定的抑制，且
NBT、MTS和
PMS试剂昂贵。紫外分光光度法中黄嘌呤
和尿酸的紫外吸收波长较接近，直接进行紫外检测，干扰严重。其余两种方法操作繁琐，仪器设备要求
高而难于推广。本实验根据辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）［9］和黄嘌呤氧化酶的反应特
性，提出了用
XOD偶联辣根过氧化物酶，直接测定黄嘌呤氧化酶活力的新方法。

2实验部分

2. 1仪器和试剂
U-300型紫外
-可见分光光度仪（日本日立公司）；H. H. S 11-2R恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；
高速冷冻离心机（日本
Hitachi CR22G型）。0.67 U /mg黄嘌呤氧化酶（
Sigma公司）；250 U /mg辣根过
氧化物酶（上海双向西巴斯科技有限公司）；4-氨基安替比林（
AR，华东师范大学化工厂）；苯酚（
AR，国
药集团上海化学试剂公司）；黄嘌呤（99%，Fluka）；Tris（BR，国药集团化学试剂有限公司）；HCL（
AR，国
药集团上海化学试剂公司）；叠氮钠（BR，厦门新隆达试剂有限公司）。

2. 2实验方法
配制反应显色液：
4-氨基安替比林（4-Aminoantipyrine，AAP），1 mmol / L；苯酚（
phenic acid，PA），
6 mmol / L；Tris-HCL缓冲液，
50 mmol /L；叠氮钠，
0. 02%；辣根过氧化物酶（
horseradish peroxidase，
HRP），7000 U /L。在具塞试管中，依次加入
3 mL反应显色液，黄嘌呤（
xanthine，XAN）溶液
100 μL，黄
嘌呤氧化酶（XOD）酶液
50 μL。混匀，在
37℃下加热
20 min，煮沸
5 min终止反应。以不加
XOD反应
体系作为参比，测定
UV-Vis谱。

2. 3样品处理
Arthrobacter
g-X菌株液体发酵
48 h后，在
10000 r / min转速下离心
15 min，收集细胞。再将其悬浮
于
50 mmol / L Tris-HCL缓冲液（pH 7.5）中，采用
250 W超声处理
15 min。然后用
12000 r / min转速离
心
10 min，取其上清液测定酶活。

2005-08-30收稿；
2005-12-05接受
本文系福建省自然科学基金（No. C0410006）和工业生物技术*重点实验室基金（
No. KLIB-KF200502）资助项目

分析化学第
34卷

结果与讨论

3. 1酶法测定原理
黄嘌呤氧化酶在催化黄嘌呤氧化的反应过程中，每氧化
1 mol黄嘌呤，将消耗
1 mol分子氧和水，产
生
1 mol尿酸和
1 mol H2O2
。H2O2
再经过氧化物酶作用分解，可使
4-氨基安替比林与苯酚形成亚醌类
呈红色的化合物（chromogen）［10］。在可见光范围内测定该显色化合物的吸光度，即可推算出
XOD的酶
活。总反应式如下：

XODXanthine + O2 + H2O %
%%7Uric acid + H2O（1）

HRDH2O2 +AAP+PA%
%%7chromogen + H2O（2）

3. 2反应体系主要参数的确定
3. 2. 1吸收光谱全波长扫描分析按实验方法依次加入除
XOD的所有试剂，以
Tris-HCL缓冲液为参
比，扫描该体系的
UV-Vis图谱。如图
1曲线
1所示，仅在紫外区有
1个吸收峰。加入
XOD反应后再扫
描体系的
UV-Vis谱。从谱图曲线
2可看出产物在可见光区450～650 nm之间只有
1个吸收峰，选择吸
收峰值zui高的波长
508 nm作为
XOD酶活检测波长，可降低干扰。图中曲线
3在可见光区没有任何吸
收峰，说明若不添加辣根过氧化物酶，体系无法形成
红色亚醌类化合物，即不能进行
XOD的检测。
3. 2. 2酶促反应温度的确定在相同反应条件下，
考察了不同反应温度对
XOD酶活的影响。结果表
明（表
1），随着温度的升高，体系吸光度先增大后减
少，即显色物的生成量先增后减。在
37℃时，显色
物的吸光度zui高。因而选择
37℃作为检测温度，可
获*反应效果。
表
1温度对
XOD酶促反应体系的影响

Table 1 The effect of temperature on the XOD reaction system
温度（
℃）
32 35 37 40 48Temperature

A580 0. 2328 0. 2797 0. 3193 0. 2805 0. 2631

反应条件（reaction conditions）：t
= 20 min；pH 8.6。

3. 2. 3酶催化反应动力学性质分别按
3. 2实验
方法同时进行反应，在反应后
1、3、6、9、10、12、13、
18、20、25及
30 min时终止反应，测其吸光度，结果
见图
2。由图
2可以看出，在
XOD加入测定体系
图
1 XOD检测反应体系的
UV-Vis扫描图谱
Fig. 1 Absorption spectra for system of anthine oxidase
catalyzing reaction

1.加黄嘌呤氧化酶前的体系（
without xanthine oxidase）；2.加
黄嘌呤氧化酶后的体系（
with xanthine oxidase added）；3.不加
辣根过氧化物酶的体系（
without horseradish peroxidase）；检测
条件（
determination conditions）：辣根过氧化物酶（
horseradish
peroxidase，HRP）7000U / L，4-氨基安替比林（
4-aminoantipyrine，
AAP）1 mmol / L，苯酚（
phenic acid，PA）6 mmol / L，黄
嘌呤（
xanthine，XAN）1 mmol / L，黄嘌呤氧化酶（
xanthine
oxidase，XOD）49.3 U /L。
后，吸光度值随反应时间增加逐渐增大。在
20 min后，吸光度值达到zui大，用
Amax
表示。用一级动力学
方程描述吸光度与时间之间的关系曲线得到图
3，结果显示该体系反应很好地符合一级反应，动力学方
程为：ln（Amax -At）= -0. 1724t
-1. 2326，相关系数
r
= 0. 9973。虽然体系中包含两步酶反应，但是由于
HRP的催化效率*，H2O2
一经生成立刻分解出初生态氧，而且
H2O2
氧化苯酚反应比黄嘌呤的氧化反

应要快得多，故该体系的综合反应是准一级反应。

3.2. 4酶促反应体系
pH的选择在
XOD和
HRP两种酶的稳定
pH范围内，考察了
6个不同
pH对酶活力的影响。结果表明（表
2），pH对反应
体系有明显的影响。在
pH8.0～8.4范围内，随着
pH的提高，显色吸光度增大。故确定该反应体系
的zui适
pH为
8. 4。
表
2体系
pH对
XOD酶活检测的影响
Table 2 The effect of pH on the determination of XOD reaction
system

pH 7.5 8.0 8.2 8.4 8.6 9.0

A508 0. 1339 0. 1385 0. 1754 0. 1801 0. 1527 0. 1262
反应条件（reaction conditions）：T
= 37℃，20 min。

第
6期李忠琴等：辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性

图
2反应体系测定
XOD的吸光度随时间变化的曲线
图
3 XOD-HRP-PA-AAP-XAN反应体系的动力学曲线
Fig. 2 Curve of absorbance versus time in reaction systemFig. 3 Kinetic curve of the XOD-HRP-PA-AAP-XAN re反
应条件（
reaction conditions）：T
= 37℃，pH 8.6。action system

反应条件（reaction conditions）：T
= 37℃，pH 8.6。

3. 2. 5根据米氏常数选择黄嘌呤底物浓度分别
以
0. 062、0. 099、0. 308、0. 615和
1.231 mmol /L等不同浓度的黄嘌呤为基质对相同浓度
XOD（49. 3
U/L）的酶活进行测定，观察底物对酶促反应速度的影响。根据
Lineweaver-Burk双倒数作图法，线性方
程为（1/ S）= 2. 9619 ×（1/ V）+ 60. 896，相关系数
r为
0. 9987，求得黄嘌呤氧化酶的米氏常数为
K=
m

0.049 mmol /L。在酶活测定中，要求底物浓度过量，一般应大于
10倍
Km
值［11］。根据该实验结果说明
在本文中采用的
1 mmol / L黄嘌呤作为测定体系的底物浓度是适宜的。
3. 2. 6测定方法的建立首先取
3 mL反应显色液（pH8. 4）于具塞试管中，加入
100 μL黄嘌呤溶液
（1 mmol / L），在
37℃水浴中预热
1 min。然后加入
50 μL标准
XOD酶液或发酵
XOD酶提取液，混匀保温
20 min，沸水煮
5min终止反应。以不加
XOD反应体系作参比，在
508 nm波长下测定显色物的吸光度。

3. 3测定方法主要特性
3. 3. 1测定方法的线性范围将
50 μL标准
XOD酶液（35.51 U /mL）稀释至
0.55 mL（终浓度为
3. 20
U/ mL），按上述建立的测定方法，用
50 μL微量进样针分别吸取
5、10、20、30、40、50、60、70、80、90及
100
U / LXOD酶稀释液加入测定体系。以反应终止后测得的吸光度值为横坐标，
XOD浓度为纵坐标，绘制
一条标准曲线。结果表明本法所用体系测定
XOD酶活的线性范围居于5.0～100.0 U /L之间。在此范
围内的线性回归方程为：
C
= 299. 21A508 -63. 533，其相关系数
r
= 0. 9992。根据纯粹与应用化学协
会（IUPAC）的规定，计算其检出限为
1.3 U /L。
3. 3. 2显色稳定性、精密度和回收率实验将反应终止后的溶液，放置室温，每隔
10 min测定其吸光
度，考察显色终止液的稳定性。测定结果显示终止反应后
1h内，该溶液的吸光度数值没有明显的变化。
用已知
50 U /L XOD标准样品平行测定
10次，测定方法如上所述，平均结果为
49. 7U /L；S=1. 6

s

U/L；RSD = 3.2%。表明用本方法测定
XOD的精密度令人满意。

按本研究建立的测定方法，在
Arthrobacter
g-X细胞破碎粗提酶液中分别加入
0、20、50、80 U /LXOD

标准酶液，再检测
XOD酶活单位，每个试样均测定
5次。测定的回收率均大于
96%，说明该方法用于

测定细菌黄嘌呤氧化酶具有可靠性。

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Spectrophotometric
Determination
of
Activity
of
Xanthine
Oxidase
by
Horseradish
Peroxidase

Li Zhongqin1，Xu Xiaoping2，Yang Hailin1，Wang Wu#1

1

（The
Key
Laboratory
of
Industry
Biotechnology，Ministry
of
Education，
Southern
Yangtze
University，Wuxi
214036）

2

（College
of
Chemistry
and
Chemical
Engineering，Fuzhou
University，Fuzhou
350002）

Abstract
A novel technology to determine the activity of xanthine oxidase（
XOD）through the chromogenic
reaction of 4-aminoantipyrine（AAP），phenic acid（PA）and hydrogen peroxide（H2O2），which was produced
via the oxidation of xanthine catalyzed by XOD，under the help of horseradish peroxidase（
HRP）
was
proposed. The influences of temperature、pH and amount of substrate on the activity of XOD were investigated.
The optimal conditions to determine the activity of XOD were obtained as follows：horseradish peroxidase（7000
U/L），4-aminoantipyrine（1 mmol / L），phenic acid（6 mmol / L）and xanthine（1 mmol / L）were dissolved in
50 mmol / L Tris-HCl buffer solution（pH 8.4），the reaction temperature was 37℃，the reaction time was 20
min，the detective wavelength was 508 nm. Under the conditions mentioned above，the linear range of calibrationcurve
wasbetween5.0 U /Land100.0 U /L，and the detection limit was 1. 3 U / L. All these show this
technology is a potential alternative method to determine the activity of XOD in the areas such as laboratory
and clinical diagnosis etc.
Keywords
Xanthine oxidase，horseradish peroxidase，activity determination，spectrophotometry

（
Received 30 August 2005；accepted 5 December 2005 ）

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA