通用名称：猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒
【包装规格】 50T/盒
【预期用途】
本试剂盒利用实时荧光PCR原理，定性检测，对引起的疾病诊断及疗效评估有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒【主要组成成份】
序号 组成 25T/盒 50T/盒
1 RT-PCR反应液 375 μL×1管 750 μL×1管
2 逆转录酶 50 μL×1管 100 μL×1管
3 Taq酶 75 μL×1管 150 μL×1管
4 阳性对照 40 μL×1管 40 μL×1管
5 阴性对照 40 μL×1管 40 μL×1管
6 说明书 1份 1份
注：阴性对照为偶蹄兽类基因组DNA，阳性对照为失去活性的cDNA。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。
【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
1. 适用标本类型：发病动物血液、空肠及小肠肠内容物及组织脏器(肠道组织、肠系膜及淋巴结等)和病毒培养液。
2. 标本采集，方法如下：
(1) 血清：用一次性注射器取静脉血2-3ml，转至5ml 的干燥管中，密闭送检。
(2) 肠内容物：无菌条件下取肠道内容物约1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理盐水)的5ml 离心管中，立即送检。
(3) 组织脏器：取发病动物肠道组织及肠系膜淋巴结等组织约1g，置一1.5ml的洁净离心管中，密闭送检。
3.应避免标本间交叉污染。
4.标本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融。
【检验方法】
1.试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂，充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数
单反液配制表(每份) RT-PCR反应液 15.0 μL
逆转录酶 2.0 μL
Taq酶 3.0 μL
(3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。
2.样本准备（样本处理区）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。
4. PCR（PCR扩增区）
（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒
反应体积 25 μL 通道选择 FAM通道采集荧光信号
PCR
反应
条件 步骤 条件 循环数
反转录 42℃：10分钟（min） 1
预变性 95℃：3分钟（min） 1
预扩增 95℃：5秒（s） 5
55℃：40秒（s）
PCR扩增 95℃：5秒（s） 40
55℃：40秒（s）
（此阶段结束时采集荧光信号）
注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。
（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
2.标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。
（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
【检验结果的解释】
通道及检测结果 标本检测结果解释
FAM
阳性（＋） 标本中检出RNA
阴性（－） 标本中未检出RNA
【检验方法的局限性】
1.当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的低检出*可能会发生假阴性的结果。
2.被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
3.样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。
【产品性能指标】 产品的低检出限为102 Copies/mL，产品CV值≤5%。
猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒【注意事项】
1.整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
2.为避免RNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
3.每次实验应该设置阴、阳性对照。
4.试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
5.试剂盒内所配阴性和阳性对照在次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
6.为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
7.仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。
8.ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正，淬灭基因选择None。
9.实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。
猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒
