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猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒

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2019/3/29 8:39:01

通用名称:猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒

【包装规格】  50T/盒

【预期用途】

本试剂盒利用实时荧光PCR原理,定性检测,对引起的疾病诊断及疗效评估有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对的高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒【主要组成成份】

序号 组成 25T/盒 50T/盒

1 RT-PCR反应液 375 μL×1管 750 μL×1管

2 逆转录酶 50 μL×1管 100 μL×1管

3 Taq酶 75 μL×1管 150 μL×1管

4 阳性对照 40 μL×1管 40 μL×1管

5 阴性对照 40 μL×1管 40 μL×1管

6 说明书 1份 1份

注:阴性对照为偶蹄兽类基因组DNA,阳性对照为失去活性的cDNA。

【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。

【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

1. 适用标本类型:发病动物血液、空肠及小肠肠内容物及组织脏器(肠道组织、肠系膜及淋巴结等)和病毒培养液。

2. 标本采集,方法如下:

(1) 血清:用一次性注射器取静脉血2-3ml,转至5ml 的干燥管中,密闭送检。

(2) 肠内容物:无菌条件下取肠道内容物约1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理盐水)的5ml 离心管中,立即送检。

(3) 组织脏器:取发病动物肠道组织及肠系膜淋巴结等组织约1g,置一1.5ml的洁净离心管中,密闭送检。

3.应避免标本间交叉污染。

4.标本收集后可立即检测;若不能立即检测,可置于2~8℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应冻存于-80℃以下,避免反复冻融。

【检验方法】

1.试剂准备(试剂准备区)

(1)从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

(2)核算当次实验所需要的反应数(n),并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数(1T)+阳性对照数(1T)+误差预留量(1T)+样本数

单反液配制表(每份) RT-PCR反应液 15.0 μL

逆转录酶 2.0 μL

Taq酶 3.0 μL

 (3)在无菌离心管中加入上述试剂,充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。

2.样本准备(样本处理区)

用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3.加样

在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品,终体积为25 μl/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。

4. PCR(PCR扩增区)

(1)取样本处理区准备好的PCR反应管,放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置,并记录放置顺序。

(2)按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。

猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒

反应体积 25 μL 通道选择 FAM通道采集荧光信号

PCR

反应

条件 步骤 条件 循环数

反转录     42℃:10分钟(min) 1

预变性 95℃:3分钟(min) 1

预扩增 95℃:5秒(s) 5

55℃:40秒(s)

PCR扩增 95℃:5秒(s) 40

55℃:40秒(s)

(此阶段结束时采集荧光信号)

注:ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正,设置淬灭基团选择None。

【参考值(参考范围)】

1.试剂盒有效性判定:

 (1)阳性对照:有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。

 (2)阴性对照:Ct值>38或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。

2.标本结果判定:

(1)阳性:标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。

(2)可疑:标本检测结果Ct值在35~38范围内。此时应对标本进行重复检测,如重复实验结果Ct值仍在35~38范围内,有明显指数增长期,则判定为阳性,否则为阴性。

(3)阴性:标本检测结果Ct值>38或无Ct值。

【检验结果的解释】

通道及检测结果 标本检测结果解释

FAM

阳性(+) 标本中检出RNA

阴性(-) 标本中未检出RNA

【检验方法的局限性】

1.当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的低检出*可能会发生假阴性的结果。

2.被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。

3.样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染,则容易得到假阳性结果。

【产品性能指标】 产品的低检出限为102 Copies/mL,产品CV值≤5%。

猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒【注意事项】

1.整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作,各区实验服、仪器、耗材应独立使用,不能混用;实验用吸头采用带滤芯吸头;样本处理区应配有生物安全柜,样本处理在生物安全柜中进行操作;三个区应该配有紫外线杀菌装置。

2.为避免RNA降解,样本处理过程应在0-4℃条件下操作,且完成实验后立即上机检测;样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。

3.每次实验应该设置阴、阳性对照。

4.试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀,并应瞬时离心。

5.试剂盒内所配阴性和阳性对照在次使用前应全部转移至标本准备区,并单独存放。

6.为防止荧光干扰,应避免裸手直接接触PCR反应管,并应避免在PCR反应管上进行任何标记。

7.仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置;不同批号试剂不能混用。

8.ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正,淬灭基因选择None。

9.实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。

猪圆环病毒型荧光定量RT-PCR试剂盒

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