HPLC故障排除2 - 保留时间问题

2.保留时间问题

2. 保留变量（时间变动）

如果所有峰（色谱峰）的保留时间均发生了变化，其致因很可能是如下因素发生了变化：流动相的组成、色谱柱的化学性质、色谱柱的温度或流速。

如果等度或梯度流动相在在线式混合中出现错误，也可能导致保留时间出现问题。

下面将简要介绍这些问题来源（对上述每个原因都简述如下）。

2.1.如果操作人员操作不当，则会导致流动相组成的意外变化，例如使用在线式混合系统时，流动相混合物（系统）设置不正确；或替换新批次流动相时，未妥善制备新的流动相（新流动相配制不正确）。

在极少数情况下，会出现流动相组分选择性损失的情况，例如蒸发。

当流动相发生变化时，峰形（色谱峰）通常会向相同的方向移动，以缩短或延长保留时间（保留时间变长或变短）；而相对保留（选择性因子，a）通常会发生变化。

检查流动相组成错误的蕞佳方法是仔细检查（复查）系统设置；如有必要，应制备新的流动相。

方法文件应包含特定流动相变化影响的相关信息。例如，有机溶剂或pH值的微小变化会对色谱图产生特征（在色谱图体现出特征性的）影响，如分辨率或保留的变化（分离度的变化或保留时间的漂移）。

如果您怀疑设备出现故障，请将色谱柱和流动相移至另一个HPLC系统，然后再次运行。

如果问题依然存在，则问题在于流动相或色谱柱；如果问题不再出现，则可能与其他系统组件或参数相关。

2.2.色谱柱化学（化学性质）变化会在色谱柱的整个生命周期内出现，并且一般会在数周或数月内逐渐变化。柱老化一般伴随着柱背压的上升、保留时间的逐渐变化（漂移）（更长或更短）以及更多的峰拖尾。

更换新柱以确定是否是柱老化导致的问题（可确证色谱柱老化）。

500-2000次注射（进样）的柱寿命是较为理想的；在这一点上，柱成本相较于整体分析，是十分微小的，所以更换新柱的可行性较高（色谱柱在整个分析的成本中所占比例低，因而可以合理更换色谱柱）。

如果色谱柱的使用寿命过短，应仔细检查操作条件，以确保它们适用于该色谱柱。

图5显示了在操作条件下，色谱柱寿命较短的示例（缩短的寿命）。

2.3.色谱柱温度变化会导致保留时间的变化：每1°C的温度变化会引起1-3％的保留时间变化。如果不使用柱温箱（即“室温”条件），由于实验室温度的变化，温度通常会在日间（和夜间）循环（周期性）变化。

虽然在室内恒温器的测量下，实验室温度显示为恒定，但是HPLC系统的微观（微）环境可能会发生显著变化，尤其是当供暖或空调通风口直接吹向系统时，温度变化极为明显。

使用柱温箱可以避免色谱柱出现这样的温度问题，且HPLC系统应远离通风口放置。

2.4.流量（流速）问题可能是因存在气泡、泄漏或泵问题（故障）导致的。
气泡问题应和低压（或脉动压力）以及保留时间的增加相关（可能伴有柱压过低或柱压波动，且保留时间延长）。

对于双头泵，如果只有一个泵头存在气泡，则流量和压力可能会发生脉动（跳动）。

应对流动相进行脱气，然后打开放气阀清空泵，并向泵中多次加入5-10mL的流动相，以正常流速流经泵，从而排出气泡（打开排气阀以正常流速的几倍泵入5-10ml流动相经过泵，以排出气泡）。

在某些情况下，可能需要使用低粘度的脱气溶剂，如甲醇（MeOH）或乙腈（ACN）来清除泵中顽固的气泡。

泄漏也会延长保留时间。配件（接头）上的滴水配件或玻璃体内的结晶沉淀都是泄漏的证据（查看接头如有液滴或结晶析出，可证明有泄露）。

请特别注意色谱柱上游的配件（之前的接头）。

自动进样器内的配件和密封件（接头和密封圈）可能难以检测，可借助手电筒和小镜子进行检查。

如果使用不锈钢配件，通常1/4的紧固螺母（将接头螺好再拧紧1/4圈）便可以阻止泄漏。

使用PEEK配件（接头）时，应停止泵，松开接头，将管子推到配件（接口）端口的底部，然后在重新启动泵之前拧紧配件（接头）。

拧紧PEEK配件（接头）时如果存在流动的液体，会导致管道在配件中滑动，产生柱外死体积，进而影响分离效果。

存在缺陷的止回阀（单向阀）或磨损的泵密封件（圈）会导致流量偏低或波动。

止回阀（单向阀）出现问题将导致压力的波动。如果在清除泵中气泡后还无法改善压力波动的情况，则止回阀（单向阀）可能存在故障。

可以更换新的止回阀（单向阀）；也可以将止回阀（单向阀）放置在（装有）MeOH的烧杯中，对其进行超声处理，以实现有效的清洁。

如果无法有效区分入口端和出口端之间的止回阀（如不易分清入口单向阀和出口单向阀），请划线标记或用标签标记烧杯。将每个止回阀（单向阀）放入单独的烧杯中进行清洁，使其分开清洁。如果部件滑出，应小心组装，以免受到污染（无尘手套，避免划伤部件等）。

随着使用时间的增加，泵密封件（圈）会出现磨损；而且使用缓冲流动相或将其置于高盐条件下（例如离子交换法），会缩短它的使用寿命。

您可以建立一个预防性维护计划，定期更换密封件并做相应记录（准确记录更换密封圈的时间间隔，就可以建立预防性的维护计划），从而在故障发生前更换密封件。如果无其它指标（征兆），应至少每年更换一次密封件（圈）。

2.5.比例阀和在线混合发生故障会降低梯度洗脱的效果（使梯度洗脱效果变差）。

图6示例显示了两次连续注射肽样品的梯度洗脱分析。在这种情况下，系统适用性测试允许两次运行之间存在0.1分钟的变化（保留时间变化）；个峰值不符合该标准，后一个峰值勉强通过而中间两个峰值明显超出规定值。

图6. 两个连续梯度运行的（两次连续梯度洗脱）色谱图显示了梯度中点附近的峰形具有较大的误差（保留时间的误差较大）（13分钟）。来源[3]。

下面介绍了一种检查流动相配比（混合）精度的简单方法。

将柱更换为0.005英寸直径约1米长（0.12mm）的管道（取下色谱柱，换上长约1米，内径0.005英寸（0.12mm）的管路），在A容器中加水，且B容器中放有含有0.1％丙酮的水，将检测器波长设置为265nm，并使用足够高的流速使止回阀（单向阀）能够有效工作（例如2mL/min）。

以10％为增量运行一系列梯级（梯级实验）（10％、20％、30％……90％、100％B）。

由于问题经常出现在50％B附近，所以在45％B和55％B处增添了额外的梯级。

其结果应是平滑的阶梯状（参见图8a）。

对于图6的样品，在40％-60％B的梯级中观察到图7的曲线。

梯级是扭曲的（已变形），且45％到50％B的梯级（梯级变化）是8.4％而不是5％。

图7中的虚线近似于（拟合了该）梯度，同时（在）45％和50％B之间存在偏移。

因此，此处应是由具有较大保留变量的峰被洗脱导致的（不幸的是，这正是那些保留时间偏差较大的峰出峰的位置）。

HPLC系统可对比例阀进行调节。

当执行此操作时，梯级会变得平滑且保留时间也会处于规格范围之内。

图7. 在图6的梯度中点附近执行配比（比例）阶梯测试的结果。理论值显示在括号内。来源[3]。

如果系统性能良好，其阶梯测试的结果应与图8a类似，在整个图中呈现阶梯状。

未注射的0-100％B梯度是应运行的对比测试（另需同时进行一无进样的0-100%B梯度试验）。

它应显示为线性基线、线性梯度部分和线性后期梯度保持，每个部分之间均是平滑的曲线过渡（线性梯度部分以及一段梯度升高后维持直线，每两段之间为平滑曲线过度）。

图9的示例显示了在约25％、50％和75％B的线性（箭头）条件下，空白梯度运行呈现有规律的偏移。

图8. 图9显示了HPLC系统的梯度阶梯测试结果。（a）0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100％B的梯级；（b）以1％的梯级向上跟踪至45-55％。箭头显示了50和51％之间的“较短”梯级。来源[4]。

与这些条件相对应的阶梯测试如图8a所示，并且在这个度量（放大比例）下表现良好。

为了更仔细地检查问题区域，在45-55％B范围内以1％的增量进行阶梯测试，如图8b所示。

这个扩展（放大）图清楚地显示了在50％和51％之间的梯级中，存在不规则性。

在线性图中的定期（有规律间隔的）误差（图9）表明，控制比例阀的算法或比例阀本身存在问题。

在目前的情况下，调整控制（控制软件）软件无法解决问题，因此应更换比例阀，以解决问题（因此更换了比例阀，问题被解决）。

图9. 故障比例阀线性梯度图。箭头显示线性偏离；绘制下面的虚线以供参考（虚线为标准参考线）。以1mL/min的速度运行梯度0-100％B 15分钟；A =水、B = 0.1％丙酮水溶液；检测UV 265nm。来源[4]。

尽管可以假设单一来源是导致特定HPLC问题的原因（虽然通常可以假定某HPLC问题只有一个故障原因），但情况并非总是如此。

图10a显示了以非常浅的梯度（30分钟内19-24％ACN）连续三次注射肽样品的结果（显示了一种多肽样品三次连续进样，窄梯度洗脱（30分钟内19-24%乙腈梯度洗脱））。

由于怀疑存在流量（流速）问题，因此在双活塞双泵系统中更换了所有8个止回阀（单向阀）和4个泵密封件（圈）。

这大大改善了保留变量（保留时间大为改善），保留范围从2.1分钟变化到1.0分钟（图10b），但仍然是（此偏差仍）不可接受的。

为了进一步研究问题，将溶剂预混合到装有15% ACN的A容器和装有25％ACN的B容器中（在A瓶中预混合15% 乙腈，在B瓶中预混合25% 乙腈）。

当调整仪器设置以产生与图10a和b相同的梯度时，获得图10c所示的结果。尽管仪器的配比精度在±0.1％的规格范围内，但对于非常浅（窄）的梯度来说仍是不够的。

预混合溶剂将有效精度从0.1％提高至0.01％，如果该样品希望具有令人满意的保留时间再现性，这点是必需的。

预混合可以提高系统性能，以满足苛刻的分离要求。

图10.三次连续注射肽样品的扩充（放da）色谱图。产生的色谱图：（a）使用原始系统配置（b）更换所有止回阀（单向阀）和泵密封件（圈）后（c）使用预混流动相。色谱柱：250×4.6mm、5mC18以1.5mL/min和35℃运行，并在215nm检测。梯度：30分钟内19-24％ACN / 0.1％TFA的水溶液。来源[5]。