ELISA技术之间接法测抗体

所用的方法称为间接法，也是目前zui常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
    此法是测定抗体zui常用的方法,属非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗（针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。
    间接法首先用抗原包被于固相载体，这些包被的抗原必须是可溶性的，或者至少是极微小的颗粒，经洗涤，加入含有被测抗体之标本，再经孵育洗涤后，加入酶标记抗抗体，（对人的标本来说即加酶标抗人球蛋白IgG、IgM），再经孵育洗涤后，加底物显色,底物降解的量，即为欲测抗体的量，其结果可用目测或用分光光度计定量测定，本法用不同种抗原包被固相载体后，只要用一种酶标记抗人球蛋白，即可作多种人的传染病、寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断。如用酶标记抗人IgM,则可用于早期诊断。
操作步骤：
　　（1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。# @* F# f6 Y1 s& K） i# P
　　（2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
　　（3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。- @7 m+ J  C2 j1 L; W" r
　　（4）加底物显色
间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子（如抗人IgG）,因此该法只需要换固相抗原，即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体，具有更广泛的通用性。（ ]# L6 ~0 K& z- \\6 a% M
　　本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
　　间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
　　间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。