【普渡大学2019 OPRD案例】采用荷兰Chemtrix微通道反应器快速按需合成抗癌药物洛莫司汀
【背景介绍】
洛莫司汀（Lomustine），是一类被广泛使用的高亲脂性烷基化抗癌药物，通过在体内产生氯乙基碳离子和碳酰化中间体，这些亲电化合物攻击DNA上的亲核部位，形成烷基化产物，从而发挥药效作用的。其他类别的抗癌药物，比如链霉素、博来霉素和蒽环类，需要生物激活作用（bioactivation）来与细胞靶点反应，而洛莫司汀不需要预激活。不同于作用于鸟嘌呤的N7烷基化试剂，洛莫司汀则在O6形成氯乙基化加合物，进而导致链间DNA的交联。如果DNA不进行修复，这种交联会在DNA复制过程中导致双链断裂，终细胞凋亡导致细胞死亡。洛莫司汀作为一种可口服抗肿瘤药，每6周服用一次。它早是在20世纪60年代后期进行的临床试验评估，并于1976年获得FDA的批准，用于治疗原发性和转移性脑肿瘤以及霍奇金淋巴瘤。百时美施贵宝初以CeeNu品牌持有该药物的zhuanli。2014年，FDA批准Next Source Biotechnology公司被以Gleostine的商标对洛莫司汀进行重新包装。近，Gleostine的平均批发价格出现了大幅上涨，其原因是处理致癌化合物所产生的监管风险 。因此，这促使我们努力开发一种通过连续流动技术合成洛莫司汀的方法。
流动化学技术近在工业界和学术实验室中都进行了广泛的探索，被证实是一种有效的合成技术。与传统的釜式合成工艺相比，由于连续流技术可以快速混合和控制反应参数，进而更好地控制反应条件和选择性，如温度、化学计量、压力和保留时间。强化的传热和传质能力也提供了更安全的操作条件。连续流合成的工艺强化可以有助于提高化学反应效率，缩短反应时间，减小反应规模，提高产品的质量和一致性。因此，原料药的连续流合成技术在近几年变得吸引力。然而，由于工作条件、溶剂切换和流速差异等因素的限制，通过连续流技术有效地执行多步反应仍然是一个挑战。此外，连续流方法的反应条件的优化和分析技术仍需要大量人力物力的投入。
【连续流方法】
Purdue大学的David H. Thompson课题组近日报道了洛莫司汀通过连续流合成的新工艺方法，并使用解吸电喷雾电离质谱（DESI-MS）对其进行分析检测指导工艺的优化方案。终工艺路线是两个反应串联在一起，不分离中间体，具备反应器装置简易、原料廉价等特点因此可以降低生产成本（反应流程如图1所示）。相关结果发表在Org. Process Res. Dev.2019，23，3，334-341（DOI：10.1021/acs.oprd.8b00387）杂志上。
图1 使用连续流技术两步串联法合成洛莫司汀的工艺路线，其中4 = NaNO2/HCO2H ，5 = tBuONO
洛莫司汀合成的步在室温下是快反应。在连续流中对该反应的温度、溶剂和投料比进行优化，进而确定获得大产品收率的条件。检测反应使用TLC和MS，其中MS使用正离子模式下三重四极质谱仪，以快速探测出每种反应条件下的全质谱和产物离子分布。
为了揭示步的佳条件，作者设计了一种级联方法。运用荷兰Chemtrix微通道反应器，选用 3225 SOR静态混合区芯片，泵送环己胺（1），1-氯-2-异氰酸乙酯-乙烷（2）和三乙胺（TEA）溶液，自动进样器自动收集小瓶中的产品（如图2所示）。蒸发反应混合物，用冷Et2O洗涤白色固体并真空干燥，然后用TLC、MS、MS/MS和NMR（1H和13C）分析。
图2 合成中间体 3的Chemtrix微反应器 glass reactor chip (SOR 3225). A = 1 in THF; B = 2 in THF, C = TEA in THF.
作者对该步反应使用的保留时间（τ）、反应温度（T）、1-氯-2-异氰酸乙酯/环己胺比等条件进行探讨。如图3所示，在较长的保留时间下，EtOH为溶剂的产品产量急剧下降（Entry1-3），原因是因为1-氯-2-异氰酸乙酯会被溶剂醇解，尽管3在ACN中的收率很高，但它在该溶剂中的溶解度很低，导致严重堵塞。对于甲苯和Et2O，即使在低浓度下也发现了类似的堵塞问题（Entry7-8）。而在溶剂THF中，产率在在50 oC下30 s达到大值（Entry9-14），并且由于高温会导致产物分解，温度升高，产率会下降（Entry13-14）。提高2的当量可以提高产率（Entry15-21），而延长保留时间，也可能会导致产品分解(Entry21)。终，作者确立了佳的反应条件：τ = 60 s, T = 50 °C, 1.4 当量的1-氯-2-异氰酸乙酯。在该条件下，反应的高产率可达到92%（Entry 20）。
图3 合成中间体3的反应条件筛选
对于第二步的合成，作者使用DESI-MS来评估溶剂、浓度和硝化试剂类型对洛莫司汀产率的影响。DESI-MS初应用于完整样本的表面分析，如癌症诊断用生物组织或药物检测指纹图谱。在近，DESI-MS方法已用于化学反应分析。该方法主要目的是在受限的体积内产生反应加速现象，比如在MS喷雾电离过程的微液滴中，通过这种技术可以达到5ms的分析速度，每小时接近一万个反应点。
作者使用了这项技术来研究两种亚硝化方法，首先，评价了亚硝酸钠、甲酸作为亚硝化试剂对中间体3向洛莫司汀转化的效率。然后将该转化率与亚硝酸叔丁酯（TBN，5）作为亚硝化试剂进行比较。用DESI-MS研究了NaNO2/HCO2H体系不同反浓度和溶剂条件下的转化效果。在探究中，洛莫司汀的分子离子峰m/z= 234未被观察到。对市售洛莫司汀样品的分析两者产生了非常相似的质谱，这表明电离过程中该分子很容易发生碎裂。通过三重四极质谱与电喷雾电离，以及离子阱质谱联用DESI，质谱中得到了一个稳定的固体碎片离子在m/z 169。该反应产生的洛莫司汀碎片与市售的洛莫司汀相匹配这一事实进一步证实了这一点。THF/H2O中所有NaNO2浓度的反应比ACN/H2O的反应效果更好（图4a）。此外，与THF/H2O反应相比，来自3的碎片在ACN/H2O反应中为丰富，表明起始物质在ACN/H2O中的转化相对缓慢。接下来，将8种不同溶剂（EtOH、MeOH、DCM、ACN、甲苯、DMSO、THF和EtOAC）进行结果比较优化连续流合成。所有八种溶剂都使用4作为亚硝化试剂并得到了类似的结果（图4b）。当使用5作为硝化试剂时，在除THF和EtOAc以外的所有溶剂中都检测到洛莫司汀（图4c）。
图4 DESI-MS 样品盘显示了在合成洛莫司汀的条件筛选中是否存寻找的离子峰，蓝色点表示m/z169出现了（成功反应），红色点则表示没有出现（不成功反应） (A) NaNO2作为硝化试剂时的浓度筛选. (B) NaNO2作为硝化试剂时的溶剂筛选(C) tBuONO 作为硝化试剂时的溶剂筛选
接下来，作者利用DESI-MS高通量实验中得到的反应条件来优化连续流合成，并检查由DESI-MS确定的不成功反应在流量条件下是否会产生负迁移。从DESI-MS实验中可知，THF是使用4进行亚硝化反应的佳溶剂。由于亚硝化试剂是吸湿的并且容易氧化成硝酸盐，反应常常会使用过量的4，进而将3大限度地转化为洛莫司汀。总的来说，DESI-MS实验在投料比、试剂和溶剂方面与流动反应条件的结果非常一致。在连续流反应中筛选洛莫司汀的转化率（图5）。作者使用TLC和MS检测反应。初，在0°C、保留时间为30s的条件下。令人欣慰的是，在这么短的反应时间内获得了洛莫司汀，虽然转化率很低（图6，Entry1）。适当提高保留时间可以提高转化；然而，较长的保留时间似乎增加了对洛莫司汀的分解(Entry2-6)。同时，作者将温度保持在0°C，以避免NaNO2分解成高温下产生的重氮盐。
图5 合成洛莫司汀的微反应器，在 Chemtrix 3225 SOR glass reactor chip中使用NaNO2 /HCOOH（4）作为硝化试剂，A = 3 in THF; B = HCO2H , C = NaNO2 in MeOH/H2O (4:1).
接下来，作者对洛莫司汀的不同分离chun化方法进行了评价。首先，用Et2O（3次）萃取产物，以利用3在该溶剂中的低溶解度（Method 1）。不幸的是，薄层色谱分析显示有机层和水层中都存在3。只好将有机萃取物经无水Na2SO4干燥并在真空中浓缩以产生黄色油，该油在Et2O中重新溶解，在冰浴中冷却以从混合物中沉淀3。对滤液的NMR分析显示，仍有22%的3残留在分离的洛莫司汀产品中。接下来，作者换用ACN（Method2）重结晶来纯化产物。虽然得到了非常纯的洛莫司汀，但使用这种方法的回收率很低。后，作者发现使用石油醚热过滤可去除不溶性杂质3（Method3）。干燥后滤液浓缩得到纯的洛莫司汀，通过NMR分析检测不到3。采用此方法，在0°C，保留时间为5分钟，3当量4的反应条件下，以74%的分离收率得到纯的洛莫司汀。
图6 使用4作为硝化试剂时，不同反应条件下洛莫司汀的分离收率
当使用5作为亚硝化剂时，作者也在保留时间、温度和溶剂方面对反应进行了优化（反应装置如图7所示）。结果表明，在保留时间（8分钟）、降低温度（25°C）和增加5的比率（3当量）的条件下，通过方法3chun化后，洛莫司汀有了进一步的提高（91%分离收率）。
图7 合成洛莫司汀的微反应器，在 荷兰Chemtrix 3225 SOR glass reactor chip中使用tBuONO（5）作为硝化试剂，A = 3 in ACN/ EtOH (3.7:1); B = 5 in ACN.
下一步研究了连续流装置下的两步串联反应，作者使用荷兰Chemtrix反应器来观察碳酰化和亚硝化反应。然而，在两个步骤之间需要萃取，以去除反应中存在的三乙胺，避免在第二步骤中竞争性地消耗亚硝化试剂。作者通过在亚硝化步骤之前使用市售Zaiput液-液萃取器去除碱，并通过使用FEP管式反应器重新优化合成来实现这一目标（图8）。开始时，佳反应条件为：步在50°C下，保留时间1分钟，第二步在0°C下，保留时间5分钟，得到43 mg（总收率51.8%）的chun洛莫司汀（图9，Entry 1）。在使用4作为亚硝化试剂的条件下，通过改变步或第二步的保留时间来提高FEP管式反应器中洛莫司汀产率是不能成功的（Entry 1-4）。
图8 利用4做为硝化试剂，两步串联法合成洛莫司汀的实验装置
而在随后的实验中结果表明，5比4是一种更好的合成洛莫司汀的亚硝化试剂。终的优化条件包括步在50℃下的1分钟反应时间和第二步在25℃下的8分钟反应时间（如图10所示）。由于从步提取的少量三乙胺对TBN活性产生了影响，降低所用三乙胺的量使得洛莫司汀产量增加（表4，Entry 7-9），通过该反应装置制得110 mg的洛莫司汀（表4，条目9），总收率为63%。通过这种串联反应路线制得的洛莫司汀的经TLC、NMR（1H和13C）、MS和MS/MS表征与市售的洛莫司汀样品的测定值相同。
图9 串联反应合成洛莫司汀的条件筛选
采用液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）对合成的洛莫司汀进行chun度鉴定，并将该物质的总离子色谱（TIC）值与市售的洛莫司汀标准品进行比较。TIC与商业标准品*重叠，没有出现任何新的副产品。
图10 利用5做为硝化试剂，两步串联法合成洛莫司汀的实验装置
【实验结论】
1.作者利用DESI-MS开发了一种快速连续合成洛莫司汀的方法，指导了二步整体转化中第二步反应条件的优化。
2.该工艺采用9分钟的总保留时间，以63%的总分离收率生产chun品洛莫司汀，与釜式反应相比，无论从收率和效率方面都有了很大的提高。
3.亚硝酸叔丁酯（5）是一种温和而的亚硝化试剂，并且可以通过简单的提取、过滤和洗涤来分离chun洛莫司汀。这是一个更快更绿色的合成工艺，该工艺可以显著缩短反应时间，减少废物产生，避免任何色谱分离步骤。使用这种方法，每小时可以产生110 mg的洛莫司汀。同时作者也在对洛莫司汀放大生产和在线再结晶进行探讨。
Reference
Org. Process Res. Dev.2019，23，3，334-341
公司简介：
深圳市一正科技有限公司，作为荷兰Chemtrix公司（微通道反应器）、英国AM公司（连续多级搅拌反应器、催化加氢系统）、英国NiTech公司（连续结晶仪、连续合成仪）在中国区的代理商和技术服务商，为广大高校和企业提供连续合成、在线萃取、连续结晶、在线过滤干燥、在线分析等整套连续工艺解决方案。
公司与复旦大学、南京大学、中山大学、华东理工大学、南京工业大学、浙江工业大学、河北工业大学等高校研究机构合作成立微通道连续流化学联合实验室，致力于推动连续流工艺在有机合成、精细化工、制药行业、能源材料、食品饮料等领域的应用，合作实验室可以为客户的传统间歇釜式工艺在连续流工艺上的转变提供工艺验证、连续流工艺开发工作，促进制药及精细化工企业由传统间歇工艺向绿色、安全、快速、经济的连续工艺转变。
公司与荷兰Chemtrix B.V.在浙江台州、江苏南京合作组建了连续流微通道工业化应用技术中心（以下简称“工业化技术中心”），旨在打造集连续流微通道工艺开发、中试试验、工业化验证、技术交流于一体的综合性连续流微通道应用技术服务中心，以为广大生物医药企业、化工类企业提供专业、完善的智能化连续流工艺整套系统解决方案及技术服务方案。
