肺泡灌洗和痰涂片、mNGS结果均为曲霉菌，痰和肺泡灌洗培养出来的却是根霉菌，哪个环节出了问题？血mNGS结果为猫立克次体，序列总数53152条，而肺泡灌洗却只有5条支原体？二代测序结果为阴道加德纳菌，肺泡灌洗测出70多种细菌，是操作不当还是病人存在严重的卫生问题？
以上实例都是临床使用mNGS时出现的问题，浙大一院呼吸与危重症医学科的周华医生在中青年呼吸学者论坛上进行了分享，那么，mNGS对病原学的诊断与传统方法相比有什么优势？mNGS出现假阴性或假阳性时，我们该怎么办？为何反复强调小心验证的重要性？
感染性疾病诊断的核心难题是「病原诊断」
在开发出NGS技术之前，即使用遍所有的方法去诊断感染性疾病，还是会面临很多困难，也就是说很多感染性疾病的病人无法及时精准诊断病原体，导致治疗延误或者治疗不当，增加致死率，加重医疗花费。现在应用mNGS技术之后，很多病人还是无法明确病原体，因此我们需要探索新的方法。
目前病原微生物鉴定的检测技术有哪些？
病原学检测方法包括培养和非培养的方法。其中非培养方法包括直接涂片法，多用于细菌、真菌、 分枝杆菌检测；还有抗原/抗体检测，很早以前核酸检测就应用于临床，以前基于PCR技术或者多重PCR技术来做病原体检测，随着二代测序价格下降，二代测序就被用于临床做感染病人的病原学诊断。
mNGS对病原学诊断与传统方法相比，具有什么优势
mNGS指宏基因组二代测序（Metagenomic Next-generation Sequencing），临床也称之为二代测序、宏基因组测序、高通量测序。
宏基因组测序（Metagenomic Sequencing）对病原学诊断与常规的培养相比具有理论优势。
优势是没有偏移性，比如一个标本中既有曲霉菌又有白色念珠菌，培养时，如果白色念珠菌生长较快，便会影响曲霉菌的生长，假如一口痰中既有白色念珠菌又有奴卡菌，白色念珠菌生长有优势可能影响了奴卡菌的阳性率。所以培养是有偏移性的，但理论上说，宏基因组测序对病原学诊断没有偏移性。
优势是广覆盖，对于常规的感染性疾病的诊断来说，我们根据临床思维，判断高危因素和病原体，选择必要的检测手段，如果评估不全面可能导致漏检。理论上，宏基因组测序可以没有偏移的把标本中所有病原体的核酸都检测出来，所以覆盖面更广。
优势是高效率，可以同时检测多种病原体。
mNGS诊断方法的优势：「一网打尽」
类比一下，传统的病原学检测方法如同钓鱼一样，需要加上诱饵（引物或抗原抗体），一次只钓一种鱼，或者使用多重PCR的方法，放几个鱼钩一起钓，一次性钓几种。而病原宏基因组学方法学就如同撒一张大网去全面覆盖各种病原菌，将可能致病的病原菌一网打尽。
二代测序除了用于病原学诊断，还有哪些用途？
二代测序不仅可以用于病原学检测，也可以在病原培养后做深度的二代测序，甚至全基因组分析。现在主要用于临床的还是临床标本病原学检测，通过检测可以知道标本中含有的病原体。如果测序量能够进一步突破，它除了可以把标本中里所有微生物的核酸测出来外，也可以把人体表达的所有RNA测出来，帮助判断定植或者感染。比如铜绿假单胞菌测出来后，人体有没有针对它产生炎症反应，还可以判断是定植还是感染，但目前还在探索阶段，尚常规未用于临床。
mNGS检测有几步？
目前对于二代测序来说，给它一个临床标本，不经过培养的话，还是只能用于病原学诊断。使用二代测序来做病原学诊断有六个基本步骤，一个是采集感染部位样本，后一步是报告解读，中间有四个步骤分别为提取核酸、高通量测序、生物信息分析、检测结果报告，这四步都不由临床医生操作，由实验室技术人员操作完成。其实我们临床医生要做好一步和后一步，也要了解中间的四步，在报告解读的时候需要了解其中的技术问题，这样才能读懂报告。
