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免疫系统是由先天免疫系统和适应性免疫系统组成的保护机体免受外界病原体侵害的系统。硬骨鱼类生活在病原菌丰富的水环境中，广泛接触多种病原菌，先天免疫系统在硬骨鱼类中发挥着更为重要的作用。吞噬作用是先天性免疫应答的重要机制之一，它通过吞噬细胞吸收病原体，降解摄入的病原体，激活免疫应答。这一进展始于模式识别受体（PRRs）对病原体的识别，PRRs包括凝集素、Toll样受体、NOD样受体和B类清道夫受体以及其他受体。B类清道夫受体参与了吞噬作用，但对其在硬骨鱼类中的作用的认识还很有限。B类清道夫受体包括CD36、SR-B和溶酶体整合膜蛋白2（LIMP-2），LIMP-2在溶酶体和晚内切体的限制膜中的表达，LIMP-2的过度表达导致了早内切体和晚内切体/溶酶体的增大，一些研究已经报道LIMP-2在哺乳动物中的免疫作用，但是LIMP-2在硬骨鱼类中的免疫作用还不清楚。

大菱鲆是我国海水养殖为广泛的鱼类之一，常患有鳗弧菌和海豚链球菌感染等细菌性疾病。为了制定防治措施，青岛农业大学杨宁教授科研团队对大菱鲆细菌感染过程中的免疫相关基因及其相关活性进行了研究，此外，黏膜免疫反应是宿主防御的第yi道防线，对于生活在病原菌丰富的水生环境中的水生生物更为重要。更好地了解黏膜免疫反应有助于通过浸泡或喂养来制定疾病控制和预防措施。基于以上问题，作者试图描述大菱鲆的LIMP-2基因结构、不同细菌感染后粘膜组织中LIMP-2的表达情况，以及LIMP-2的微生物配体结合活性和凝集活性，以初步了解其在硬骨鱼类中的免疫作用。

基本信息

题目：

Identification and initial functional characterization of lysosomal integral membrane protein type 2 (LIMP-2) in turbot (Scophthalmus maximus L.)

期刊：Developmental & Comparative Immunology

影响因子：3.119

PMID：31176756

作者单位：青岛农业大学

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摘要

免疫系统保护生物体免受外来病原体的侵害，这一进展始于模式识别受体（PRRs）对病原体的识别。B类清道夫受体作为PRRs的一种，在吞噬功能中发挥着重要作用。在三种B类清道夫受体中，LIMP-2被报道存在于溶酶体和晚内切体的限制膜中，但是它在硬骨鱼种中的免疫作用仍然局限于少数物种。在此，作者对大菱鲆LIMP-2基因进行了研究，分析了LIMP-2基因在不同细菌感染后黏膜屏障中的表达模式以及LIMP-2与不同微生物配体的结合活性和与不同细菌的凝集活性。作者鉴定出一个具有1593 bp开放阅读框（ORF）的SmLI

MP2基因，多个物种的比较和系统进化树分析表明，该基因与牙鲆的亲缘关系密切，基因组结构和共线性分析显示了LIMP-2在进化过程中的保守性。在组织分布分析中，SmLIMP-2在所有被检测的大菱鲆组织中均有表达，其中脑组织表达水平高，肝组织表达水平低。此外，SmLIMP-2在革兰氏阴性菌鳗弧菌感染后所有粘膜组织（皮肤、鳃和肠）中均显著上调，在革兰阳性菌链球菌感染后的鳃中上调。后，rSmLIMP-2与所检测的所有微生物配体均表现出较强的结合能力，并与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鳗弧菌有较强的凝集作用。综上所述，该研究结果表明SmLIMP-2在鱼类对细菌感染的免疫反应中起着重要作用。然而，需进行进一步功能研究，以更好地描述其在硬骨鱼类免疫中的详细作用。

研究内容及结果

1.大菱鲆LIMP2基因的鉴定

分子克隆后，获得一个具有1593bp开放阅读框（ORF）的SmLIMP2基因（GenBank登录号：MH748107）。ORF编码530个氨基酸残基，预测分子质量为59.95kDa，理论等电点为6.44。推测得到的SmLIMP2蛋白具有9个蛋白激酶C磷酸化位点、11个酪蛋白激酶II磷酸化位点和10个N-糖基化位点。此外，推测得到的SmLIMP2蛋白有55个带负电的残基（Asp+Glu），52个带正电的残基（Arg+Lys），不稳定性指数为37.18，脂肪族指数为87.49。与其它物种相比，SmLIMP2基因与褐牙鲆的相似性高，为97.0%，其次是大黄鱼94.9%，虹鳟94.5%，而与褐牙鲆的同源性高，为92.5%，其次是大黄鱼89.6%，半滑舌鳎94.5%。

Table 2

2.SmLIMP2基因的基因组结构分析

作者利用大菱鲆基因组数据库研究了SmLIMP2的基因组结构，并与已发表的LIMP2基因对比了外显子/内含子结构。作者发现有趣的是，在人、鼠和鸡中的LIMP2有12个外显子，而硬骨鱼类有13个外显子。而且，人和小鼠的12个外显子*相同，而鸡中只有两个外显子是与人和鼠是不同的。此外，在硬骨鱼类含有的13个外显子中，大菱鲆和斑马鱼只有1个外显子不同，大菱鲆和鲶鱼只有2个外显子不同，斑马鱼和鲶鱼只有1个外显子不同。

Figure 1

3.系统进化树分析

作者利用MEGA 6对不同物种LIMP2的氨基酸序列进行了系统进化树分析。结果显示，SmLIMP2先与褐牙鲆聚集，然后依次与大黄鱼、半滑舌鳎、虹鳟聚集。另一个进化枝由鲤鱼（C. carpio）、斑马鱼（D. rerio）和斑点叉尾鮰（I. punctatus）组成。其他较高等的脊椎动物形成了单个进化分支，包括人（H. sapiens）、小鼠（M. musculus）、鸡（G.gallus）和热带爪蟾（X. tropicalis）。

Figure 2

4.SmLIMP2基因的共线性分析

 通过共线性分析进一步验证了SmLIMP2的鉴定。结果显示，从哺乳动物到脊椎动物的物种中都观察到了LIMP2的相同相邻基因。其中在大菱鲆、鲶鱼、鸡、小鼠和人中观察到SmLIMP2的邻近基因都包含158个螺旋结构域（CCDC158）、序列相似家族47成员E（FAM47E）和具有EF-hand结构域2的蛋白磷酸酶（PPEF2）。然而，N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（NAAA）只在鲶鱼、鸡、小鼠和人中观察到。

Figure 3

5.SmLIMP2的组织分布

作者采用Real-time PCR的方法，研究了SmLIMP2在大菱鲆皮肤、鳃、肠、血、肝、脾、头肾、脑等8种健康组织中的组织分布规律。结果显示，SmLIMP2在所有被检测的组织中广泛表达，其中，在脑中表达水平高（26.44倍），其次是肠（9.93倍）和皮肤（6.03倍），而在肝脏中表达水平低（对照）。

Figure 4

6.细菌攻击后SmLIMP2的表达谱

为了研究SmLIMP2在大菱鲆粘膜组织中的免疫作用，作者用革兰氏阳性菌S.iniae和革兰氏阴性菌V.anguillarum浸泡攻击大菱鲆后，检测了SmLIMP2在大菱鲆粘膜组织（鳃、皮肤和肠）中的表达谱。

在感染S.iniae后，SmLIMP2只在鳃中上调，在皮肤和肠中下调，具体表现为：在腮中，4h快速上升6.97倍，8h快速上升4.06倍，12h迅速恢复到基础水平；在肠中，2h下降幅度大，达0.17倍，其余时间点迅速恢复到基础水平。在皮肤中，SmLIMP2在2小时下调0.37倍，8小时下调0.68倍。

在V.anguillarum感染后，三种组织中SmLIMP2的表达情况均上调。具体表现为：在腮中，在2小时时检测到高的上调，上调幅度为7.52倍。在皮肤中，在2小时时上调4.68倍，在12h时上调4.34倍。

Figure 5

Figure 6

7.微生物配体的体外结合

在表达谱分析之后，作者又研究了SmLIMP2与微生物配体的结合能力。rSmLIMP2是从大肠杆菌中纯化出来的一种天然His标记蛋白，并且只有SmLIMP2的胞外区被诱导，在western blot分析中，只观察到一条分子量为50kDa的带。后，研究了SmLIMP2与微生物配体和虹彩病毒（iridovirus）的结合能力，具体表现为：对照蛋白与被测配体没有任何结合能力，而rSmLIMP2对LPS的结合能力强，其次是iridovirus、PGN和LT。PGN和LTA均在4μg/ml时达到峰值，而LPS和iridovirus均在8μg/ml时达到峰值。

Figure 7

Figure 8

8.凝集试验

作者用凝集试验进一步鉴定LIMP2的免疫功能。在含钙的TBS缓冲液中的凝集试验表明，rSmLIMP2能够引起大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鳗弧菌强烈的凝集，其中，大肠杆菌和鳗弧菌的凝集作用更强。

研究结论

综上所述综合基因组结构、系统进化树和共线性分析，作者验证了SmLIMP-2的鉴定，并表明其与相应的脊椎动物物种显示出很强的同源性。LIMP-2在大菱鲆肠道和皮肤中的大量表达可能提示LIMP-2在大菱鲆黏膜免疫中的重要作用，但是由于LIMP-2在硬骨鱼类中的信息有限，需要进一步研究LIMP-2在不同组织和不同类型细胞中的表达水平。鳗弧菌感染后大菱鲆三种粘膜组织SmLIMP-2的表达均上调，作为模式识别受体（PRRs）的一员，黏膜组织中SmLIMP-2的快速上调提示了大菱鲆对细菌感染的病原体识别和宿主免疫激活。rSmLIMP2与LPS、PGN和LTA等微生物配体呈剂量依赖性结合，与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鳗弧菌有较强的凝集作用，根据之前的研究，这一结果暗示着LIMP-2可能参与病原体识别、抗原提呈、巨噬细胞活化和炎症过程。然而，LIMP-2在硬骨鱼类中的应用还很有限，需要进一步研究以更好地描述其在硬骨鱼类免疫中的具体作用。

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