上海研吉生物科技有限公司
2011/7/19 17:30:33使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的:本试剂盒用于测定牛血清,血浆及相关 液体样本中口蹄疫A型抗体(FMD-A-Ab)含量。 实验原理: 本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中牛口蹄疫A 型抗体(FMD-A-Ab)水平。用纯化 的抗原包被微孔板,制成固相抗原,往包被单抗的微孔中依次加入口蹄疫A 型抗体 (FMD-A-Ab),再与 HRP 标记的抗原结合,形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,经过*洗 涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终 的黄色。颜色的深浅和样品中的口蹄疫A 型抗体(FMD-A-Ab)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计算样品中牛口蹄疫 A 型抗体(FMD-A-Ab) 浓度。 试剂盒组成: 样本处理及要求: 1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上 清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。 2. 血浆:应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次 离心。 3. 尿液:用无菌管收集,离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程 中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/ 分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用 PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞 浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分 钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS(PH7.4),用手工或匀浆器 将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。分装后一份待 检测,其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品,因 NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔 10 孔,在*、第二孔中分别加标 准品 100μl,然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从*孔、第二 孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl, 混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔 中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各 取 50μl 分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl,混 匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准 品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl, 浓度分别为90 ng/L,60ng/L ,30ng/L,15 ng/L,7.5ng/L)。 2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样 品zui终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混 匀。 3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。 4. 配液:将 30(48T的 20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的 20倍)倍稀释后备用。 5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此 重复 5次,拍干。 6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。 7. 温育:操作同 3。 8. 洗涤:操作同 5。 9. 显色:每孔先加入显色剂 A50μl,再加入显色剂 B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色 15分钟. 10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。 11. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止 液后 15分钟以内进行。 注意事项: 1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未 用完,板条应装入密封袋中保存。 2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。 3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间 控制在5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 4.请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值 大于标准品孔*孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n 倍)后再测定,计 算时请zui后乘以总稀释倍数(×n×5)。 5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。 6.底物请避光保存。 7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9.本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。 计算: 以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标, 在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释 倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值 代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释 倍数,即为样品的实际浓度。 试剂盒性能: 1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。 2.批内与批见应分别小于9%和 11% 检测范围: 5ng/L -120 ng/L 保存条件及有效期: 1.试剂盒保存:;2-8℃。 2.有效期:6个月
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