上期小编为大家介绍了以单一看家蛋白作为定量Western Blot内参蛋白的分析方法,这次咱不得不说说以全蛋白为内参的分析方法。
期刊JBC(The Journal of Biological Chemistry)在Western Blot数据要求中指出,对于半定量蛋白表达的实验,优质的内参为全蛋白内参,如果以看家蛋白为内参,需要提供其在实验处理中表达量恒定的实验证明。
全蛋白作为内参的优势在于:
1、目标蛋白的相对丰度为目标蛋白强度与全蛋白强度比,不再依赖于单一蛋白强度值。
2、敏感性好。
3、线性范围宽。
4、蛋白可视化。
5、更适用于低丰度表达蛋白。
如果考虑使用全蛋白作为内参,之前只有两种方法,一是使用考染胶,平行跑两块胶,问题在于很难保证重复性;二是使用丽春红染料进行印迹膜染色,问题在于稳定差,很难实现全蛋白定量,随着荧光蛋白染色技术的问世,全蛋白定量问题得以顺利解决。
AzureRed全蛋白染色进行归一化
“总蛋白归一化”或TPN变得越来越流行,可以避免依赖看家蛋白进行归一化的许多缺点。在该方法中,将目标蛋白的灰度值与加载在泳道中的总蛋白的灰度值进行比较。TPN比使用单一蛋白作为归一化更具有优势,例如不易受样品之间蛋白变化的影响,不是观察一种蛋白的强度,而是测量每条泳道的灰度值。由于TPN技术消除了许多与信号归一化相关的问题,因此发表文章越来越多地要求使用总蛋白信号进行归一化。
AzureRed荧光蛋白染色是一种用于凝胶和印迹膜的定量总蛋白染色试剂,与下游蛋白分析兼容,包括Western Blot。AzureRed是染色应用的理想选择,包括转印后染色以确认从凝胶到膜的蛋白质转移情况,以及定量蛋白。
AzureRed总蛋白和三个靶标蛋白同时成像
向凝胶中加入稀释的HeLa细胞裂解物。转印后,将印迹用AzureRed染色,然后在不脱色的情况下加入Tubulin,ß-actin和GAPDH探针。 用Sapphire 双模式多光谱激光成像系统扫描成像。四个通道进行叠加,
总蛋白质(AzureRed染色)以灰色显示;Tubulin-红色,ß-actin-蓝色和GAPDH-绿色。
AzureRed荧光蛋白染色是荧光Western Blot定量的理想选择。宽广的线性动态范围确保AzureRed成为解决蛋白上样变化的有效标准。AzureRed的一个关键特性是将其融入现有Western Blot工作流程的简单性。
AzureRed染料可与常用荧光探针同时检测,无干扰,允许在一张印迹膜上检测多种蛋白质。使用AzureRed可以进行多色印迹的总蛋白归一化,不需要剥离和重孵育,可以在一张印迹膜上定量多种蛋白。 该方法快速,可以与感兴趣蛋白一同成像。
与常见的看家蛋白相比,AzureRed具有更宽的线性动态范围
单色通道图像A)AureRed染色总蛋白B)Tubulin C)β-action和D)GAPDH。AzureRed信号的优异动态范围与实际加载的蛋白量显示在图像(A)中。使用AzureSpot软件定量来自总蛋白和看家蛋白的信号,并将得到的值相对于每个样品加载的蛋白量(E)作图。与常见的看家蛋白相比,AzureRed表现出更强的相关性和更广泛的动态范围。
Sapphire配合AzureRed总蛋白荧光染色剂可以做总蛋白归一化和定量三个靶标蛋白,生成可以信赖的定量Western Blot数据。
Azure300带有Q模块,可激发AzureRed等染料进行全蛋白定量,后化学发光条带和总蛋白条带同时在一张膜上成像,满足Nature,JBC等期刊杂志的总蛋白定量要求,帮助用户发表文章。
专业的AzureSpot分析软件
可做AzureRed总蛋白的型号:
SapphireNIR-Q,SapphireRGB,SapphireRGBNIR;Azure300Q,Azure400,Azure500Q,Azure600
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