NGS在肿瘤检测中的那些事儿
一、背景介绍
20世纪以来，癌症已成为困扰人类健康的主要危害之一。根据2019年国家癌症中心发布的2015年全国//////新癌症统计数据，2015年恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人。平均每天超1万人被确诊为癌症，每分钟7.5个人确诊癌症。癌症负担呈持续上升态势，近10多年来，恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。因而肿瘤基因突变检测对指导肿瘤靶向治疗、耐药监测及预后判断有重要意义。
图1：中国2015年恶性肿瘤发病与死亡人数图
二、肿瘤突变类型
肿瘤突变主要来源于体细胞突变和胚系突变。
胚系突变(germline mutation)又称生殖细胞突变，是来源于精子或者卵子这些生殖细胞的突变，因此身上所有的细胞都带有突变，目前主要是BRCA1/2，一般研究较少。
体细胞突变(somatic mutation)又称获得性突变，是指在生长发育过程中或者环境因素影响下后天获得的突变，通常身上只有部分细胞带有突变。
图2：基因突变类型解析图
体细胞突变包括序列变异、结构变异、肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）。其中序列变异包括SNV(Single Nucleotide Variation)和Indel（Insertion & deletion）。结构变异包含Deletion、Duplication、Inversion和Translocation。
图3：序列变异和结构变异解析图
名词解释：
TMB就是基因中发生错误的密码总量。TMB越高，那么可能相应的肿瘤相关的致癌突变越多，每个肿瘤的个性就越突出，越不同于正常细胞。肿瘤免疫治疗的原理就是通过加强机体免疫系统对肿瘤的识别和杀伤。而肿瘤突变负荷越大（TMB越高），突变越多的癌细胞，越不像正常细胞，越容易被免疫细胞发现，自然无法逃脱免疫系统的追杀。一般认为TMB超过20个突变/Mb（Mb代表的就是每百万个碱基）就是高，低于10个突变/Mb就是低。当然，不同的公司，由于所采用的基因套餐以及技术不同，略有差异。
MSI指的是微卫星不稳定性，指的是在DNA复制过程中段片段插入或者缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象，通常由错配修复MMR功能缺陷引起。以二核苷酸重复序列（CA/GT）n///为常见，n一般是15-60次。MSI在维持基因组稳定以及调控基因表达中发挥重要作用，且个体差异较大。
三、常见的肿瘤突变检测技术
传统的肿瘤检测方法包括Sanger测序、焦磷酸测序和实时荧光PCR等，仅能对单个基因或者单个基因的外显子突变进行检测，对复杂变异类型的检测存在局限性。高通量测序（Nextgeneration sequencing,NGS）能够同时对上百万甚至数十亿个DNA///片段进行测序，因此可以在较低的成本下对多至上百个肿瘤相关基因、全外显子及全基因组进行检测。
方法 | 优点 | 局限 |
Sanger测序 | 读长较长，准确性高 | 通量小、成本高、需要样品量大 |
焦磷酸测序 | 读长较长，平均可达400bp。 | 成本高，在测序过程中引入插入和缺失的测序错误 |
实时荧光PCR | 灵敏度与特异性高，准确性较好，实现快速鉴定。适合于大量样本、少量位点 | 价格贵，不能读出序列，不太直观 |
NGS | 不依赖于已知的核酸序列，不需额外设计探针，需要样品量少，灵敏度高 | 读长短（200-500bp），可重复性低，拼接组装的难点 |
四、应用NGS进行肿瘤检测的技术路线
NGS进行肿瘤基因突变检测的技术路线主要包括：全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）和靶向捕获测序（targeted sequencing）。
图4：肿瘤检测技术路线图
全基因组测序：
全基因组测序可对整个基因组区域进行测序，包括编码区、非编码区等所有的基因区域进行测序。可实现对人类基因组范围内所有的变异类型进行分析，包括SNV、 Indel,、CNV和 SV，甚至可以进行染色体水平变异的分析。弊端是测序需要很大的数据量，成本高，而且其中以大部分数据目前尚不能解释，因此离实际临床应用还存在较大距离。
全外显子测序：
全外显子测序可对基因组上所有的基因外显子区域进行测序。全外显子覆盖人类基因组1-2%的蛋白质编码序列。相比于WGS减少了对非编码区的测序，成本更低，并且可以获得更高的测序深度和检测分辨率。但WES对于临床检测来说，肿瘤基因检测测序深度较高，所需的数据量相对较高，因此从临床应用以及成本考虑，WES并未被广泛接受。
靶向捕获测序：
靶向测序是指选择基因组上感兴趣的基因或基因区域作为靶向检测区域，可以是几个基因上的个别外显子区域，也可以是几百上千个基因上的全部外显子区域。靶向测序兼顾了实际检测需求，又降低了测序成本，因此目前在临床上的应用///为广泛。常见方法主要有：探针杂交捕获以及多重PCR扩增。
五、小结
肿瘤问题属于世界性难题，一直威胁着人类的健康，是人类生命健康的死敌。近几年随着精准医疗的快速发展，生命医疗与生物科学的准确对接，NGS已经逐步渗透到肿瘤病理分子诊断领域，大大丰富了肿瘤基因诊断的内容。NGS是目前常用的有效获取人类癌症基因组信息的高通量测序方法，能够勾画出肿瘤相关的遗传变异全景，NGS技术为肿瘤精准医疗的进一步发展提供了基础。
六、高效建库，成就肿瘤突变精准
产品名称：Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® （点这里）
产品特点：
1）建库流程更简便：片段化/末修/加A一步完成，大大缩减建库时间；
2）酶切可控时间长：酶切效果仅与时间有关，与物种来源以及样本GC含量无关；
3）接头连接更高效：接头双端连接效率高于60%，业内领///先；
4）文库扩增更均一：高深度测序条件下，均一性与KAPA HiFi Ready-mix高度一致；
5）突变检出更高效：突变检出频率与标准品预期突变更接近。
性能展示：结果表明翊圣建库试剂盒突变检出更高效。
【注】：实验样本：Horizon@HD701: Quantitative Multiplex Reference Standard gDNA
七、产品信息
产品定位 | 名称 | 货号 | 规格 |
全能型建库 | Hieff NGS® MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12200ES8/24/96 | 8/24/96 T |
Hieff NGS® Ultima DNA Library Prep Kit for MGI® | 13310ES16/96/98 | 16/96/192 T | |
酶切法建库 | Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12203ES8/24/96 | 8/24/96 T |
Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI | 13321ES16/96 | 16/96 T | |
环化试剂盒 | Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI® | 13341ES16/96 | 16/96 T |
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