课堂 | 连续断层3D重构中的超薄切片制备，ARTOS 3D了解一下？-化工仪器网-手机版

当需要以纳米级分辨率观察样品超微结构时，科学家通常借助电子显微镜（观察表面结构的扫描电镜 SEM 和观察内部结构的透射电镜 TEM）——它们是当前科研界可使用的大显微成像工具。

电镜成像要求对样品进行通常 20-150 nm的超薄切片，使用超薄切片机切割的切片厚度薄、表面平整、光滑且无人为干扰因素，因此可以满足电镜成像对制备样品的严苛要求。如果大量超薄切片具有样品结构的前后连续性，SEM 成像采集的图像就可以进行样品内部结构的 3D 重建，形成可用于分析的完整超微、精细立体图像，即连续断层成像技术（Array Tomography, AT）。

今天，小编简要介绍一下 AT 成功的关键环节：连续超薄切片样品制备。

超薄切片之重要性

AT 常用于细胞、蛋白质等生物 / 生物大分子结构的纳米分辨率、3D 结构观察和分析，主要步骤为包埋样品连续（超薄）切片、TEM / SEM 或光学显微镜对其进行成像、对获得的一系列图像进行重建分析。AT 可以获得的有效信息包括超微结构的定量、体积分析和细胞 / 蛋白的形态学数据等，相较于共聚焦显微镜获得的图像，具有更高的水平和空间分辨率（可达 0.2 nm）。

超薄切片主要用于 TEM 成像前的样品制备，以纳米分辨率观察样品内部结构信息。无污染且获取快速的超薄切片的主要优势在于：

· 整个切片均可用于电镜成像，适合大尺寸样品分析；

· 单张切片电子透射均一性好，保证结果可靠性；

· 制备速度快，短时间即可获得大量切片；

· 适用样品范围广，生物样本和工业材料均适用。

超薄切片的基本原理

对于 TEM 或者 3D 结构重建，样品高质量连续切片是前提。因此，一台如 Leica EM UC7 或者 EM ARTOS 3D（20-50 nm）（见图 1）一样稳定可靠的超薄切片机是开展实验的*工具。

▲图 1. Leica 连续超薄切片机新品 —— EM ARTOS 3D

样品被安装在可上下前后准确移动的电动机械臂上，机械臂垂直上下移动、遇到固定的玻璃刀或钻石刀时，一条样品带被切下（图 2），然后刀台自动向左移动，按照设定的切片厚度完成第二条切割。同理，随后刀台再向左移动，完成第三条切割（图 3）。从刀片上直接取下切片是十分困难的，因为它非常薄且脆弱，徕卡超薄切片机采用温和水流托举的方式使条带不断分离，能够保证条带质量不被破坏同时操作极其简单（冷冻切片情况可借助显微操作），然后进行上电镜前的其它必要处理。

▲ 图 2. EM ARTOS 3D 超薄切片机样品切割位置基本结构

▲ 图 3. EM ARTOS 3D 制备的连续超薄切片条带

连续断层成像的样品制备

多数未处理的生物样品比较柔软，AT 成像前的样品制备主要包括下面几个步骤：

· 组织固定

· 样品水分抽提和包埋

· 连续切片和切片条带收集

· 切片染色以用于成像（如果需要）

后使用 SEM 或光学显微镜（通常荧光成像情况）对结构上具有连续性的切片进行成像，合成图像以进行 3D 重建和分析。

对于市面上多数超薄切片机，使用者在 AT 成像的样品制备时，通常会发现这是一项耗时耗力、中间一些操作必须手工完成的工作。EM ARTOS 3D 是 Leica 2019 年新推出的 3D 连续超薄切片机，能够自动化连续切片、显著缩短样品制备时间、减少人工操作、切片无褶皱、厚度均一、温和水流取条带、提高样品制备成功率等众多优点，在向下兼容普通超薄切片需要的同时，特别合适高通量切片和 AT 等前沿研究对样品制备的严苛要求。

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