技术文章

原 理
1．质粒DNA的提取
把一个目的DNA片段通过重组DNA技术，进入受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（Vector）。质粒（Plasmid）作为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，广泛应用于基因操作的各个方面。因此，质粒的分离与提取是分子生物学中zui常用、zui基本的实验技术。
质粒是一种染色体外的DNA分子，其大小范围从1-200kb不等。大多数来自细菌细胞的质粒为双链、共价闭合环状的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型和松驰控制型。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。通常所用的质粒载体有pBR322、pUC18、pUC19等，本实验提取pUC19质粒。

从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。碱裂解法的原理是：碱性条件下，用十二烷基磺酸钠（SDS） 破坏菌体细胞壁，并使菌体蛋白质和染色体DNA变性，双链解开。质粒DNA具超螺旋闭合环状结构，虽变性但两条互补链不会*分离。当pH被调至中性后，质粒DNA可以恢复构型，并以溶解状态存在于液相。而细菌染色体DNA比质粒大得多，难以复性，与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，可以离心除去。

2．质粒DNA的限制性酶切及电泳检测
限制性内切酶（restriction enzyme）存在于细菌细胞中，起防御噬菌体感染的作用。由于它们对DNA 的剪切作用，因此内切酶可作为分子生物学研究者的“剪刀”广泛应用于基因操作中。

限制性核酸内切酶可分为三类，重组DNA 技术中常用的限制性核酸内切酶为Ⅱ 类酶。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列 （如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'）,有少数酶识别更长的序列或简并序列。内切酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段（如 SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

本实验是对提取的质粒pUC19 进行酶切分析。首先需要应用分子生物学软件分析质粒的酶切位点，推荐使用的软件有：Primer Premier 5.0、Vector NTI、DNAMAN 和NEB-cutter 等。DNA 限制性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA 序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA 的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是*的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。在电场中，在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移，其迁移速率由DNA 的分子大小、构象等因素决定。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（Ethidium bromide, EB） 染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng 的DNA 条带，从而可以确定 DNA 片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA 条带，用于以后的克隆操作。

一、主要仪器、 材料和试剂
1．仪器
微量移液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅）， 涡旋振荡器，恒温水浴锅等，水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液器，电炉，紫外透射仪，凝胶成像系统。
2．材料
含pUC19 的E. coli DH5α，1.5mL 离心管（又称eppendorf 管），离心管架。
质粒DNA（pUC19）：本实验提取纯化。
限制性内切酶EcoR I 和Hind Ⅲ及其缓冲液3．试剂
（1） LB 液体培养基：
蛋白胨（Tryptone） 10g
酵母提取物（Yeast extract） 5 g
NaCl 10g，
溶于800mL 去离子水中，用NaOH 调pH 至7.5，加去离子水定容至1 升，
高温高压灭菌20 分钟。
（2）LB 固体培养基：液体培养基中每升加15g 琼脂粉，高温高压灭菌。
（3）溶液Ⅰ： 50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L Tris-HCl （pH8.0）
10 mmol/L EDTA （pH8.0）。
高温高压灭菌15 分钟，储存于4℃冰箱。
（4） 溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH
1％ SDS，使用前现用现配。
（5）溶液Ⅲ： 5 mol/L KAc 60mL
冰醋酸 11.5mL
H2O 28.5mL
高温高压灭菌后，4℃保存。
（6）苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：pH8.0，棕色玻璃瓶中4℃保存。
（7）RNA 酶A（RNase A）母液：
将RNase A 溶于10mmol/L Tris-HCl（pH7.5）, 15mmol/L NaCl 中，配成10mg/mL 的溶液，于100℃加热15 分钟。冷却后用1.5mL 离心管分装成小份保存于-20℃。
（8）TE 缓冲液：
10 mmo/L Tris·Cl （pH8.0），1 mmol/L EDTA （pH8.0）。高压灭菌后4℃储存。
（9）50×TAE 电泳缓冲液： 242g Tris
57.1 mL 冰乙酸（17.4 mol/L）
200mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）补足至1L
（10）6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％（w/v） 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。
（11）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB 配制成10mg/mL，用铝箔包裹容器，储于室温。
二、操作步骤
1．质粒DNA的提取
（1）挑取LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mL LB（含抗生素，本实验为 50μg/mL 的氨苄青霉素）液体培养基中，37℃振荡培养过夜（约12-14 小时）。
（2）取1.5mL 菌液移入离心管中，室温8 000 rpm 离心，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
（3）将细菌沉淀重悬于100μl 预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
（4）加入200μl 新鲜配制的溶液Ⅱ，温和翻转数次混匀，并将离心管放置于冰上 3-5 分钟，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
（5）加入150μl 预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，此时可见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5 分钟。
（6）4℃下，12 000 rpm 离心5 分钟，吸取上清液至新的离心管中。
（7）加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃下12 000 rpm 离心5-10min。
（8）小心移出上清于一新离心管中，加入2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冰上放置半个小时，4℃下12 000 rpm 离心5-10min。
（9）用400μl 预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2 次，4℃下8 000 rpm 离心5-10min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
（10）用20-50μl TE（含RNase A 20μg/mL），37℃水浴半小时以降解RNA，-20 ℃保存备用。
2．质粒DNA的限制性酶切及电泳检测
2.1 DNA 酶切反应
（1）利用分子生物学软件Primer Premier 5.0 或Vector NTI 查找质粒DNA 的酶切位点，选择相应的限制性内切酶，预测酶切产物的电泳结果。
（2）取1.5mL 离心管，用微量移液器分别加入DNA 5μg 和10 倍的反应缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl 酶液，充分混匀。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
（3）混匀反应体系后，将离心管置于浮子（或插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温 2-3 小时，使酶切反应*。
（4）每管加入10 倍的上样缓冲液，充分混匀以停止反应，置于冰箱中保存备用。
2.2 琼脂糖凝胶的制备及DNA 电泳检测
（1）取50×TAE 缓冲液20mL 加水至1000mL，配制成稀释缓冲液，待用。
（2）胶液的制备：称取0.4g 琼脂糖，置于200mL 锥形瓶中，加入50mL TAE 稀释缓冲液，放入微波炉里（电炉上）加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8 ％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
（3）胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏（宽约1cm）紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（EB 溶液使其终浓度为0.5μg/mL（也可不把EB 加入凝胶中，而是电泳后再用0.5μg/mL 的EB 溶液浸泡染色）。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶*凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入TAE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
（4）加样：取10μl 酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液器小心加入样品槽中。若DNA 含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip 头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作。
（5）电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时，停止电泳。
（6）染色：未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL 的EB 溶液 或Gelred 染液中，室温下染色20-25 分钟。
（7）观察和拍照：采用凝胶成像系统进行。
DNA Marker 和琼脂糖（Agarose）。