白蛋白分泌、CYP3A4活性分析

原代人类肝细胞(PHH)体外培养模型人类肝脏功能，可以产生与真实体内药物代谢非常相似的代谢谱。而PHH培养是研究体外肝细胞生物学、肝功能和药物诱导肝毒性的金标准，但常规的2D水平 PHH培养由于受到去分化和肝特异性功能迅速丧失的限制，所以我们需要寻求一种更稳定的体外模型构建方法，从而能够真实反映体内肝脏结构及功能，并具有更好的有效培养时长。

研究PHH细胞球模型在长时间培养、白蛋白分泌、CYP3A4活性分析、包括是否可以维持肝细胞特异性功能如ATP合成等方面进行了综合分析，数据均表明其在长时间培养期间是稳定的。另外在第5、7、14和第21天的基因表达谱分析中，白蛋白和CYP3A4等肝细胞特异性基因的表达量均高于2D培养组。在此基础上，通过两种药物完成了药物诱导毒性的肝损伤模型建立和相关功能验证。

这些结果表明，PHH 3D模型系统是一种很有前途的体外肝功能评估体系作，为我们未来工作的一部分，研究项目正在积j引入非实质肝细胞如Kupffer细胞和从星型细胞构建3D模型，以评估和拓展各种肝脏疾病模型构建的可行性。

图1-A PHH 3D细胞球构建流程（培养5天或者更少的时间趋于稳定）

图1-B PHH 3D细胞球模型在Nunclon™ Sphera 96孔U底板中呈现稳定均一的状态

图2 PHH 3D 细胞球验证，右图为构建成功的3D模型

原代肝细胞球特点：

1- 稳定培养时间较长（2D培养时长4~6天 vs 3D Spheroids 培养时长为数周）

2- 肝细胞球中CYP3A4活跃程度较高

3- 肝细胞球中蛋白及基因表达高度接近体内表达水平

注：并不是所有的培养细胞均能成球形，需要进一步验证

图3 基于培养耗材的3D 模型验证

上图分别对比了Nunc™Sphera™U型底96孔板和其它聚苯乙烯类培养容器，Nunc板材因其具有的超低细胞吸附力而促进了细胞球以及类器官的长期稳定培养。

图4-A PHH 3D细胞球相较2D培养，白蛋白及CYP3A4基因表达水平均呈现一致性高表达

图4-B PHH 3D细胞球相较2D培养，CYP3A4活性均呈现高水平

图5 PHH 3D细胞球相较2D培养特异性敏感度较高，同时对两种药物毒性诱导结果进行分析，3D模型IC50分析更加接近于体内代谢水平

图6 肝内胆管细胞球模型评估

通过Thermo Scientific™ CellInsight™ CX7高内涵平台对培养14天的HepG2细胞球（左图）和培养7天PHH细胞球（右图）进行高通量图像采集及评估（CFDA\DAPI标记，10x物镜），PHH肝胆管细胞球模型呈现更加清晰的结构。

图7-A 细胞球大小及ATP产量与接种细胞数量成正比

（图中显示每孔接种1500个细胞的成球状态更加均一和稳定，约200µm的直径）

图7-B 上图显示细胞接种数量和ATP产量呈正比关系

本研究提供的数据明确显示，经过优化培养的PHH细胞球模型可以保持至少在21天内表现为稳定的形态维持、较高的活力和保持肝细胞特异性功能等特征。同时图6也充分显示肝胆管模型的成功构建并且可以保持较好的肝细胞特异性功能和稳态，且有持续的白蛋白表达。在充分验证PHH 3D细胞球可保持较高的活性基础上，可以开展药物诱导的细胞毒性研究，在保持较长培养时长和优化细胞用量的同时，更好地开展肝细胞功能的高通量药物筛选和持续性研究。

文献仅供参考！