安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠以及脱氢乙酸均为食品添加剂，安赛蜜、糖精钠为甜味剂，苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸为防腐剂。我们这次尝试将五种食品添加剂共同分析，以提高检测效率。
GB5009.28-2016条件下分析
首先，我们尝试按照GB5009.28-2016食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定项下方法，使用SUPERIOREX ODS S5; 4.6 mm i.d.×250 mm色谱柱，对安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸混合标准品进行分析。
结果如下图所示，在国标原条件下可达到五种物质分离度大于2.5的良好分离结果（峰上所标数值为分离度）。
HPLC Conditions ：
色谱柱：SUPERIOREX ODS S5; 4.6 mm i.d.×250 mm
流动相：20 mmol/L 乙酸铵：甲醇=95:5
流速：1.0 mL / min
温度：35 °C
检测：PDA 230 nm
浓度：各约0.1 mg/mL
进样量：10 µL
随后，我们尝试使用SUPERIOREX ODS S5; 4.6 mm i.d.×250 mm色谱柱在相同条件下，对市售饮料及糕点实际样品进行分析，结果如下图所示，饮料样品中未检出五种添加剂，糕点样品中可检出山梨酸、脱氢乙酸峰，整体分离结果及峰形良好。
HPLC Conditions ：
色谱柱：SUPERIOREX ODS S5; 4.6 mm i.d.×250 mm
流动相：20 mmol/L 乙酸铵：甲醇=95:5
流速：1.0 mL / min
温度：35 °C
检测：PDA 230 nm
浓度：40 mg/mL
进样量：10 µL
样品：饮料样品：以水为稀释剂稀释至40 mg/mL；糕点样品：称取样品400 mg于10 mL容量瓶中，加5 mL水超声20min，冷却后加入400 µL 92 g/L的和400 µL 183 g/L的乙酸锌溶液，加水定容超声5 min，离心，过滤。
国标原流动相基础上加甲酸进行分析
为了进一步改善脱氢乙酸峰形及各物质间分离，我们尝试在国标流动相基础上加入2 mmol/L甲酸，同时为避免酸性物质保留过强，采用梯度洗脱的方式来进行分析。结果表示，本方法可在20 min内得到五种物质分离度大于4.9的良好分离结果，且各峰峰形均得到明显改善。但由于甲酸的加入导致出峰顺序有所改变，苯甲酸、山梨酸保留有所延长。
下图分别为采用此流动相方法分别对混合标准品和实际样品的分析结果。
HPLC Conditions ：
色谱柱：SUPERIOREX ODS S5; 4.6 mm i.d.×250 mm
流动相：A：20 mmol/L 乙酸铵+2 mmol/L甲酸 B：甲醇
B(%)5%(0min)→5%(5min)→40%(15min)→40%(20min)→5%(20.1min) →5%(35min)
流速：1.0 mL / min
温度：35 °C
检测：PDA 230 nm
浓度：各约0.1 mg/mL
进样量：10 µL
HPLC Conditions ：
色谱柱：SUPERIOREX ODS S5; 4.6 mm i.d.×250 mm
流动相：A：20 mmol/L 乙酸铵+2 mmol/L甲酸 B：甲醇
B(%)5%(0min)→5%(5min)→40%(15min)→40%(20min)→5%(20.1min) →5%(35min)
流速：1.0 mL / min
温度：35 °C
检测：PDA 230 nm
浓度：40 mg/mL
进样量：10 µL
样品：饮料样品：以水为稀释剂稀释至40 mg/mL；
糕点样品：称取样品400 mg于10 mL容量瓶中，加5 mL水超声20 min，冷却后加入400 µL 92 g/L的亚铁和400 µL 183 g/L的乙酸锌溶液，加水定容超声5 min，离心，过滤。
使用4.6x150 mm规格色谱柱进行分析
为了缩短分析时间，我们也尝试使用GB5009.28-2016方法以及上面提到的国标原流动相基础上加甲酸的方法，使用4.6x150 mm规格的SUPERIOREX ODS色谱柱，对安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸混合标准品进行分析。如下面结果所示，使用150 mm柱长的色谱柱，可以缩短分析的时间。
HPLC Conditions ：
色谱柱：SUPERIOREX ODS S5; 4.6 mm i.d.×150 mm
流动相：20 mmol/L 乙酸铵：甲醇=95:5
流速：1.0 mL / min
温度：35 °C
检测：PDA 230 nm
浓度：安赛蜜、糖精钠、苯甲酸各约0.1mg/mL；山梨酸、脱氢乙酸各约0.067 mg/mL
进样量：10 µL
HPLC Conditions ：
色谱柱：SUPERIOREX ODS S5; 4.6 mm i.d.×150 mm
流动相：A：20 mmol/L 乙酸铵+2 mmol/L甲酸 B：甲醇
B(%)5%(0min)→5%(5min)→40%(15min)→40%(20min)→5%(20.1min) →5%(35min)
流速：1.0 mL / min
温度：35 °C
检测：PDA 230 nm
浓度：各约0.1 mg/mL
进样量：10 µL
总结
综上所述，按照GB5009.28-2016食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定项下方法，无论使用柱长150 mm还是250 mm的SUPERIOREX ODS色谱柱，均可得到安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠以及脱氢乙酸五种食品添加剂混合标准品的基线分离结果。
流动相中加酸的梯度条件可明显改善色谱峰形及分离，但苯甲酸、山梨酸保留会变强，五种物质出峰顺序较国标原方法会有所变化。若想进一步改善糖精钠、苯甲酸之间的分离度，可适当延长初始有机相运行时间。
本次所选的饮料样品中不含本次检测的五种食品添加剂；糕点样品中检出山梨酸、脱氢乙酸。使用250 mm柱长的SUPERIOREX ODS色谱柱可得到两种样品的良好分析结果。
由于食品样品多种多样，本次只选择两种样品，很难说具有广泛代表性，客户可根据自己的样品情况对分析条件进行进一步优化。
