奥林巴斯倒置显微镜的工作原理是物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像A'B'。A'B'靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。
奥林巴斯倒置显微镜能够输出更明亮、反差更高的图像，若经常使用，则每次用完后应用擦镜纸蘸取少许的酒精对显微镜镜头进行清洁，并用抹布擦拭显微镜镜身，确保干净无灰尘。若长期不用，应每个月至少通电一次，并用上述方法用擦镜纸对镜头进行清洁保养。
