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pH值是细胞系高效生长的关键。

例如，大多数细胞系在pH 7.2-7.4时繁殖最好，成纤维细胞在pH 7.7时繁殖旺盛，转化细胞系在pH 7左右时表现优异。为了跟踪细胞生长过程中培养基pH值的变化，在某些情况下使用苯酚红作为pH值的指示剂，pH值为7.4时为红色。苯酚红在酸性溶液中变为橙色(pH 7)和黄色(pH 6.5)，在碱性溶液中变为粉色(pH 7.6)和紫色(pH 7.8)。然而，在活细胞成像中常用的培养基配方避免使用酚红，因为其光吸收消光系数高，可能造成背景噪音。

pH缓冲系统通常包含碳酸氢钠和外部供应CO2。此外，合成的生物缓冲液，如HEPES，可用于短期研究时缓冲培养基。当细胞外溶液不能用HEPES缓冲时，CO2被输送到系统，当与细胞外溶液接触时分解为碳酸氢盐。这就是为什么显微镜下的活细胞成像通常需要专门可调节大气而设计的培养室。一般情况下，10-20mM HEPES缓冲液的浓度可以在无CO2存在时控制pH值，为碳酸氢钠提供最佳的生长条件。

细胞系对氧气的需求量变化很大。

哺乳动物细胞在体内呼吸通常需要氧气，但在体外培养成种子细胞系或永生化后，通常可以替代厌氧糖酵解。但大多数活细胞成像实验并不需要严格的O2调控。有趣的是，氧气的消耗经常被用作一种策略，以减少通过与活性氧的反应而发生的光损伤。这一策略可能涉及氧气消耗系统，如氧化酶或抗氧化剂，如维生素C，以限制自由基的损害。然而，在某些情况下，O2张力降低可能导致缺氧应激，这对细胞是有危险的。

大多数细胞系在260 ~ 320 mosM的渗透压值范围内高效生长。当添加HEPES来改变培养基组分时，监测培养基的渗透压是很重要的。大多数成像室容纳小体积，在培养基温度较高时，由于蒸发作用，渗透压会发生变化。在大多数情况下，显微镜有一个二氧化碳控制的孵育室，用于在37摄氏度下处理哺乳动物细胞。低渗培养基可以在培养皿中常规替代，以补偿蒸发。也可以通过将培养基密封在一个开放的机油室或通过控制湿度来最小化蒸发。

在短期研究中应用大体积培养基可以避免由于蒸发而造成的渗透压和O2的偏差。长期研究可采用加热机组、加湿器孵育室、碳酸氢盐缓冲系统相结合的方式对环境参数进行控制。

为了更好地解释活体细胞成像实验的结果，通常采用先进的宽视野和共聚焦显微镜技术。例如，细胞的生长和发育是在相位对比和差分干涉对比(DIC)显微镜下观察的，但发育胚胎研究有时更倾向于在立体显微镜下观察。另一方面，荧光技术被用来标记特定的细胞化合物，使它们在共聚焦显微镜下更容易观察到。然而，活细胞成像系统被限制在一定的最佳条件下，以确保细胞保持在健康的状态。