Gibson Assembly原理
Gibson Assembly原理示意图
In-Fusion Cloning利用了In-Fusion酶能够识别3’末端碱基，具有3’→5’外切酶活性的特点。通过In-Fusion酶产生5’黏性末端，互补重叠片段退火配对；再将重组片段转化到感受态细胞内，重组片段序列中的缺刻在菌体内进行连接，获得重组序列。
无缝克隆的优势
不受酶切位点限制
适用于任意载体、任意片段
一步连接1或多个片段，连接多片段耗时短
插入目的片段两端不会添加额外序列（如保护碱基）
无缝克隆实验关键影响因素
片段质量
确保DNA片段无核酸酶及其它酶污染、无乙醇等残留；
纯度正常：A260/A280值在1.6-1.9、A260/230值在2左右、紫外吸收峰图正常；
浓度正常：插入片段与线性化载体浓度高于50 ng/μl，会使重组效率提高；
若模板浓度低、纯度低，则连接效率降低。
载体线性化方法
线性化载体可以选择反向PCR或酶切的方法：
可根据在载体插入位置是否有合适的酶切位点选择具体方法。因Gibson Assembly反应体系内无双链DNA连接酶，不会发生载体自连，线性化载体不需要进行末端去磷酸化处理。酶切制备线性化载体建议使用双酶切，且酶切后采用胶回收的方法回收产物，这样利于降低假阳性。
若没有合适酶切位点或者多次酶切制备线性化载体均不成功，可以选择反向PCR扩增，但不适合较大质粒，如超过8 kb。
引物设计
目的片段引物设计：目的片段引物是由目的片段两端序列加同源臂序列组成，同源臂长度设置在16-45 bp，Tm值在58–65°C。同源臂越长，有利于重组置换，但可能会影响目的片段扩增；
载体引物设计：确定目的片段插入位置，推荐借助Snapgene软件设计反向PCR引物。
PCR扩增
反向PCR制备线性化载体及扩增目的片段时需要使用高保真酶；
制备线性化载体后使用Dpn I内切酶消化环状质粒模板，降低假阳性克隆。
插入片段与线性化载体摩尔比
10 µl 反应体系，载体与插入片段总加入量建议在 0.01-0.3 pmol。插入片段与线性化载体的最佳摩尔比为 1:1-4:1；片段与片段的摩尔比为1:1。
推荐使用GenStar 克隆连接反应体系计算工具，快速计算载体与目的片段使用量。
感受态转化效率
插入片段与载体全长超过10 kb，属于长片段克隆，应使用高效感受态；如：转化效率大于108 cfu/μg DNA的感受态细胞。
感受态细胞与重组质粒用量比例不小于10:1。
只要注意以上几点，高效无缝克隆实验轻松get。
什么？不清楚无缝克隆实验具体怎样操作？
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