慢病毒的相关操作方法与问题解答

慢病毒（Lentivirus）是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它可以感染分裂细胞和非分裂细胞，可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。此外，慢病毒具有嗜核性，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而可以在体内较长期表达。慢病毒的多种优点，使它成为基因传递的强大而有效的工具，获得了广泛的应用。因此，慢病毒成为了实验室的一大常客。在使用慢病毒的过程中，我们会遇到一些问题，比如细胞转染效率低，细胞状态差等等。为了在实验过程中更好地使用慢病毒，我们应该注意哪些问题呢？

慢病毒载体是经过处理的HIV，理论上对人体是无害的，但病毒仍然具有潜在的生物学危险，慢病毒相关实验需要在生物安全柜（BL-2级别）内进行操作。因此在进行操作的时候，我们要按照如下基础规范进行实验：

1、在进入实验室工作时，穿着实验服或隔离服，戴上手套和kou罩；

2、操作病毒时请尽量使用生物安全柜，小心不要产生气雾或液体飞溅；

3、如果使用普通超净工作台操作病毒，请在打开含you病毒的容器盖子前关闭超净台的风机（由于超净台风向外排，有可能将病毒吹向操作者），并尽快操作；尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间，封闭所有含you病毒的容器、耗材、废液后，再打开超净台风机；

4、如果操作时台面you病毒污染，请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去；

5、如需离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后离心；

6、实验结束，脱掉手套前先消毒再摘除手套，随后用肥皂洗手。

慢病毒的储存与稀释

1、病毒长期储存于-80℃冰箱，-20℃保存不要超过1周，4℃保存不要超过3天；

2、病毒的运输采用干冰，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保存（于3天内用完）。若短时间内不用，收到病毒后应立即放入-80℃冰箱进行长期保存。病毒使用过程中要避免反复冻融，否则会降低病毒滴度；

3、一般病毒可在-80℃存放1年，但存放时间超过6个月后使用，需重新检测病毒滴度；

4、需要稀释病毒时，将病毒从-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解，然后用PBS或培养基（不含血清）稀释到所需浓度后轻柔混匀，尽快使用；

慢病毒的使用

预实验摸索慢病毒的最佳MOI

每种细胞对慢病毒的敏感性不同，有些容易感染，有些不容易感染，不同慢病毒的荧光强度也有差异，所以进行慢病毒操作实验之前，首先要了解MOI的概念，MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指病毒感染细胞的比例。

选择合适的MOI值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高，相对细胞的毒性越小。对于分裂活跃的细胞，比如293细胞MOI=1时，95%以上的细胞均可以表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低，MOI值可能达到200-300。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等）感染细胞MOI值的摸索。

1、感染前一天，一般用24孔板接种2×10?个细胞，第二天病毒感染时的细胞汇合度达到40-50%左右；

2、MOI值的设置若有文献参考，可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值，举例：文献中某细胞系慢病毒MOI值为10，则设置MOI梯度为2.5,5,10,20,40等；若无文献参考可按10倍梯度稀释进行设置，每个梯度3次重复；

注：（1）每孔加病毒量（μL）=MOI*细胞数/滴度（TU/mL）*10?

一般第二天按照细胞数倍增计算;如果病毒滴度很高，每孔加病毒量过少，可进行稀释后再加；Polybrene（常用浓度为5-10μg/mL）是否添加根据细胞种类及具体实验决定；

3、第三天（加病毒后12h-24h左右），弃去含病毒就培养基，更换新鲜培养基继续培养；

4、第五天，观察荧光情况，并进行拍照，确定蕞适合MOI值；

5、对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长病毒感染时间，根据细胞状态决定何时更换培养基，保持细胞的活性。

慢病毒感染目的细胞

1、通过感染预实验，确定细胞接种密度、最佳MOI等条件。正式实验前，调整并保持良好的细胞状态；

2、按实验需要将细胞铺板（qPCR检测用12孔板，WB检测用6孔板或更大面积的培养皿），细胞数以第2天密度约40-50%为宜，37℃ 培养过夜；

3、感染前，从-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化，用PBS稀释成所需浓度，用移液器吹打均匀；

4、感染前给细胞换液，然后向每孔中均匀滴加稀释好的病毒液，轻轻摇匀，37℃培养过夜；

5、感染后根据细胞状态决定，更换新鲜的*培养液，继续37℃培养。若病毒对细胞无毒性也可不换液。感染后48-72h观测荧光，拍照记录；

6、根据需要，或收细胞抽提RNA检测目的基因在mRNA水平的表达，或收细胞抽提蛋白检测目的蛋白的表达，或收细胞进行细胞功能检测；

7、在培养过程中，需要筛选稳定携带 Puromycin 抗性基因的病毒，则需换上含适当浓度 Puromycin 的新鲜*培养液。