北林：NMT发现NO促Pb吸收并诱导Ca2+流紊乱 为NO增强Pb毒性

基本信息

主题：NMT发现NO促Pb吸收并诱导Ca²⁺流紊乱 为NO增强Pb毒性的机制研究提供证据

期刊：Plants

影响因子：2.632（2019年）

研究使用平台：NMT重金属创新平台

标题：Nitric Oxide Enhances Cytotoxicity of Lead by Modulating the Generation of Reactive Oxygen Species and Is Involved in the Regulation of Pb²⁺ and Ca²⁺ Fluxes in Tobacco BY-2 Cells

作者：北京林业大学荆艳萍、武佳叶、张越

检测离子/分子指标

Pb²⁺、Ca²⁺

检测样品

4日龄BY-2细胞

铅是已知对动植物都有毒害作用的重金属。据报道，一氧化氮（NO）参与植物对不同重金属胁迫的响应。本研究分析了外源和内源NO在铅诱导烟草BY-2细胞毒性中的作用，使用非损伤微测技术（NMT）重点研究了NO在活性氧（ROS）生成以及Pb²⁺和Ca²⁺流速中的作用。Pb处理诱导BY-2细胞死亡并迅速产生NO和ROS，而NO爆发发生早于ROS积累。2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide（cPTIO）消除NO导致ROS减少，硝普钠（SNP）补充NO导致ROS积累增加。此外，外源NO的加入刺激了Pb²⁺的内流，从而促进了细胞对Pb的吸收，加重了Pb对细胞的毒性，而去除内源性NO则产生了相反的作用。此外，研究还发现，外源性和内源性NO均增强Pb诱导的Ca²⁺外排和钙稳态紊乱。这些结果表明，外源和内源性NO通过促进Pb²⁺的内流和积累，干扰钙稳态，在Pb胁迫诱导的BY-2细胞死亡中发挥重要的调节作用。

离子/分子流实验处理

1、250 μM Pb(NO₃)₂处理BY-2细胞10 h

2、250 μM Pb(NO₃)₂+0.5 μM SNP处理BY-2细胞10 h

3、250 μM Pb(NO₃)₂+100 μM cPTIO处理BY-2细胞10 h

4、0.5 μM SNP、100 μM cPTIO实时处理

本研究用250 μM Pb (NO₃)₂处理4日龄烟草BY-2细胞，立即用NMT测定Pb²⁺流速。250 μM Pb (NO₃)₂处理后，Pb²⁺内流速率恒定，平均值为70.40±2.70 pmol cm^-2·s^-1（图1A）。添加0.5 μM SNP后，Pb²⁺内流显著增加，达到160.56±32.83 pmol cm^-2·s^-1，显著增加128.06%。与单独Pb处理相比，100 μM cPTIO处理显著抑制了Pb²⁺的内流，甚至出现6.75±0.85 pmol cm^-2·s^-1的Pb²⁺净外排（图1A, B）。这些结果表明，在短时间内，SNP或cPTIO的存在显著改变了Pb (NO₃)₂处理下的的Pb²⁺流速。

图1. Pb胁迫下施用SNP和cPTIO前后NO对烟草BY-2细胞Pb²⁺流速的影响。正值代表Pb²⁺外排，负值代表Pb²⁺内流。

图2. 不同处理10 h后NO对烟草BY-2细胞中Pb²⁺流速的影响。正值代表Pb²⁺外排，负值代表Pb²⁺内流。

图3. 不同处理10 h后NO对烟草BY-2细胞中Ca²⁺流速的影响。正值代表Ca²⁺外排，负值代表Ca²⁺内流。

如图4所示，Pb胁迫诱导了Pb²⁺的内流以及ROS和NO的产生。Pb胁迫诱导的外源和内源NO作用于ROS上游，促进烟草BY-2细胞内ROS的积累和随后的细胞死亡。外源NO和内源NO均能增强烟草BY-2细胞对Pb的毒性，其机制可能与NO能刺激Pb²⁺内流，从而促进Pb的吸收，加重Pb诱导的BY-2细胞Ca²⁺稳态失调有关。这些发现会使大家对植物细胞中NO潜在的Pb细胞毒性机制有了更好的认识。

测试液

Pb²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.25 mM Pb(NO₃)₂, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

Ca²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05 mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

仪器采购信息

据中关村NMT产业联盟了解，北京地区的北京林业大学于2009年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统