人胚胎干细胞（hESC）说明书
货号：4018106
规格：1×106
储存条件：液氮储存产品简介：
（hESC）在无饲养层、化学成分明确、并且无动物源成分的人多潜能干细胞培养体系中培养，适合临床级细胞研究和应用。hESC在人多潜能干细胞培养体系中可以长期稳定快速增殖，具有典型的hESC克隆形态，表达多潜能标志物基因，长期维持正常核型，并在体内外具有三胚层分化潜能。
产品内容：
组分代码 名称 规格 数量 储存条件
4018106 人胚胎干细胞（hESC） 1×106 2 支 液氮
1002008 人多潜能干细胞复苏培养基 10 mL 2 瓶 -20℃
试剂准备：
人多潜能干细胞*培养基：室温解冻人多潜能干细胞添加剂，吹打混匀，随后将添加剂加入人多潜能干细胞基础培养基形成*培养基（每0.7mL添加剂与50mL基础
培养基混合）。人多潜能干细胞*培养基可在2 ~ 8℃稳定储存2周。
注：人多潜能干细胞添加剂需在室温解冻，可按实际用量对添加剂进行分装，分装后重新置于-80
~ -20℃保存，避免反复冻融。
细胞传代条件：
当满足以下条件之一时需要进行传代：
干细胞汇合度达到80%以上；
干细胞集落过大，中央细胞生长不良；
干细胞集落边缘有开始分化的迹象。细胞传代比例：
通常早代次（<10代）的干细胞需要以较低的比例传代，如1:2 ~ 1:4；成功建系的干细胞（10代以上） 可以1:6 ~ 1:10的比例传代，传代的比例由细胞株的生长速率决定。
比较理想的传代时间间隔是3 ~ 6天一次。
细胞传代操作流程：
1.将人多潜能干细胞*培养基取出并平衡至室温，取出包被好Matrigel的培养皿/瓶，吸去包被液并加入适量人多潜能干细胞*培养基，置于37℃恒温CO 细胞培养箱中。
2.吸走待传代细胞培养皿/瓶中的人多潜能干细胞*培养基，并且加入无钙镁的PBS溶液洗一次。
3.加入人多潜能干细胞消化液使之*覆盖皿/瓶底。
4.37℃恒温CO2细胞培养箱中孵育4 ~ 6分钟，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿/瓶底，克隆内
部大部分细胞间出现较为明显的间隙，肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白，表明细胞消化时间理想。
5.吸去消化液，即刻加入新鲜的人多潜能干细胞*培养基，用移液器扇形吹打培养皿/瓶底， 使皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀。
注：吹吸的力度要轻柔，吹打脱落和吹吸混匀的次数总共不超过10次为宜。吹打过度导致大量单细胞出现是造成细胞分化或死亡的重要原因。
注：如有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。
6.显微镜下观察细胞呈4 ~ 20个细胞大小的团块，水平十字摇匀。于室温放置10 ~ 15分钟。
7.显微镜下观察到大部分克隆贴在皿底后将细胞置于37℃恒温CO2细胞培养箱培养。
8.每天换液直至达到可以传代的标准。细胞冻存
细胞冻存操作流程：
1.配制冻存液：90% 人多潜能干细胞*培养基+10% DMSO；将人多潜能干细胞*培养基取出并平衡至室温。
2.吸走待传代细胞培养皿/瓶中的人多潜能干细胞*培养基，并且加入无钙镁的PBS溶液洗一
次。
3.加入人多潜能干细胞消化液使之*覆盖皿/瓶底。
4.37℃恒温CO2细胞培养箱中孵育4 ~ 6分钟，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿/瓶底，克隆内
部大部分细胞间出现较为明显的间隙，肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白，表明细胞消化时间理想。
5.吸去消化液，即刻加入冻存液，用移液器扇形吹打培养皿/瓶底，使皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落， 轻柔缓慢吹吸混匀。
注：吹吸的力度要轻柔，吹打脱落和吹吸混匀的次数总共不超过10次为宜。吹打过度导致大量单细胞出现是造成细胞分化或死亡的重要原因。
注：如有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。
6.按照复苏所需要的量，1 ~ 5×106/mL，每管1mL冻存。
7.以1℃每分钟的速率降至-80℃过夜（一般常见商品化程序降温盒均可提供此条件）。
8.-80℃过夜后，将冻存细胞转移至液氮保存。细胞复苏
细胞复苏操作流程：
1.将人多潜能干细胞复苏*培养基取出并平衡至室温；取出包被过人多潜能干细胞铺底工作液的培养皿/瓶，吸去包被液并加入适量人多潜能干细胞复苏*培养基，置于37℃ 恒温CO2细胞培养箱中。
2.37℃水浴解冻细胞，小心摇晃使细胞融化至仅剩一小块冰晶，迅速取出并用75%酒精消毒冻存管外表面，转移至无菌操作台中。
3.将细胞悬液转移至新的15mL离心管中，缓慢加入4mL 人多潜能干细胞*培养基，轻柔吹吸2 次混匀。
4.200g离心5分钟。
5.弃上清，加入适量人多潜能干细胞复苏*培养基重悬细胞，轻柔吹吸2次混匀，并接种到准备好的培养皿中，显微镜下观察细胞呈4 ~ 10个细胞大小的团块。
6.水平十字摇匀，于室温放置10 ~ 15分钟。显微镜下观察到大部分克隆贴在皿底后，37℃恒温CO2细胞
培养箱中培养24小时。
7.弃掉人多潜能干细胞复苏*培养基，加入新鲜的人多潜能干细胞*培养基继续培养，每天更换新鲜的人多潜能干细胞*培养基。
疑难解答：
细胞复苏率低是什么原因？
细胞复苏需使用人多潜能干细胞复苏培养基，可大大提高细胞的复苏效率。复苏过程中，转移细胞、吹打混匀和重悬细胞时，吹打力度要轻柔，并尽量减少吹打次数，细胞接种后，即刻在镜下观察
细胞团块的大小，4 ~ 10个细胞的团块为最佳。如果吹打力度过大或次数过多，导致细胞分散成单细胞，
细胞复苏率将偏低。
培养基中有沉淀状物质是否是质量问题？
添加剂在解冻过程中，会有少量沉淀析出，属于正常现象，不影响使用，请充分混匀后与基础培养基混合。但添加剂不能在37℃解冻，否则会析出大量沉淀，影响培养基的效价。如果培养基中出现大量沉淀， 请不要使用。
是否能在37℃反复水浴*培养基？
不推荐。频繁地在4℃和37℃之间转换会导致*培养基中含有的因子失活，*培养基在使用前放置至室温即可。
是否能用dispase酶或者胶原酶进传代？
在培养体系中培养的人iPSC需用非酶的温和消化方式传代，用dispase酶或者胶原酶消化细胞会对细胞造成伤害，影响传代后细胞的存活率和贴壁率。
细胞消化后成了单细胞是什么原因？
人iPSC消化成小克隆（4个以上20个以下的细胞聚集）进行传代最为适宜，消化为单细胞会短暂影响细胞的状态。造成细胞消化成单细胞的原因有：
1.人多潜能干细胞消化液消化过度，需减短消化时间；
2.对细胞悬液吹吸的力度过重，或次数过多，需缓慢吸液与吹液，每皿/瓶的吹吸次数控制在10次以下。
人ESC/iPSC在传代后不贴壁怎么解决？
造成人ESC/iPSC传代后不贴壁的最可能的原因：
1.细胞消化时间不合适；
2.消化后吹打次数不合适，使得完成传代后细胞集落过大或过小；
3.消化时间不合适，把细胞强行吹打下来。
人ESC/iPSC分化怎么处理？
1.细胞在刚复苏或传代时，小的细胞团不呈现标准的克隆形态，培养几天或传代后可恢复；
2.如果人ESC/iPSC分化的表现为干细胞克隆形态良好，克隆周边出现散在的分化细胞，可通过高比例传代（≥1:6），使得分化细胞的密度减少，低密度的分化细胞可被培养体系筛选去除， 如未*去除，可用细胞刮或巴斯德管刮除；
3.如果人ESC/iPSC分化的表现为克隆内部松散，边缘不平滑，在分化比例小或分化不严重的情况下， 可通过连续传代2 ~ 3次恢复，如果分化严重，建议弃除。
