全国江山一片红，这可不是阅兵日的朋友圈，而是在做免疫组化啊！好好的一张片子染得脏脏的。一下子整个人都不好了。这里，总结出了导致非特异性染色的八个大坑，以及避免掉坑里的一些做法。皆是独门绝技，不要眨眼咯！
1、抗体问题，真的是一分钱一分货
一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度，高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。尤其是背景非特异性染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯具，所以要注意抗体的有效期。
2、抗体浓度过高/孵育时间过长
一抗浓度太高也是出现非特异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新抗体前应该多做预实验，摸索出较为理想的工作浓度，不能简单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。解决的办法就是定时器。加上抗体后，立刻调好定时器，提醒自己及时终止反应，就会避免这个问题。
3、DAB 染色时间太长/变质
DAB 的孵育时间过长，会造成背景非特异性染色。DAB 的显色时间不是一成不变的，主要靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马上冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。DAB 要保存于避光干燥的地方，现用现配，临用前才加入 H2O2。图 1 就冲洗的有些晚了；图 2 就是刚刚好，染色效果棒棒哒!
4、内源性酶和生物素
内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是一些内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：较为常用的方法是将左旋咪唑（24 mg/mL） 加入底物液中，并保持 PH 值在 7.6-8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以用 50 mmol/L 的酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以用 0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素，染色前将切片浸于 25 μg/mL 亲和素溶液中 15 分钟，PBS 清洗 15 分钟后即可染色。也可以 24 mg/mL 的卵白素封片 15 分钟。
5、组织变干
一下子染太多片子的时候，容易出现这种情况。解决的办法就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充分覆盖组织，超出组织边缘 2 mm。然后用 PAP 笔在组织周围画一个圈圈，把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该距离组织边缘 3-4 mm。
6、浸泡时间过长
切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引起杯具。这都是偷懒的做法。但是有时候也是可以偷一下懒的。独门秘技就是 4°C 冰箱。只要把容器放在 4°C 冰箱里，过夜*没有问题。
7、清洗不充分
清洗一定要充分。PBS 液一定要双蒸水新配，用之前再次测 PH 值。缓冲液用 0.05 mol/L 的 Tris-HCL，0.15 mol/L 的 NaCl 即可。如果加一点去垢剂 Tween-20 就更好了。
8、封闭血清问题
是否选择了正确的封闭血清。原则是选择二抗动物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。用 PBS 稀释为 3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30 分钟。这里不用洗，直接甩掉即可。再贡献一个独门绝招，直接用奶粉也可以。用 5%的脱脂奶粉就可以了。而且效果还不错。怎么样？简单吧。
免疫组织化学是个苦活脏活。步骤多，时间长，还要接触有毒有害的物质。要是好好的一张 片子染出来都是全国江山一片红，那才叫亏大发了。以上，介绍了一些心得体会，希望对大家有所帮助。
