数字PCR实操结果及体会的特异性！ 导读：多年来，研究人员一直缺乏工具，来高效拷问这些差异，不过今非昔比。有了新一代DNA测序仪和质谱仪，研究人员能够以更高的分辨率、深度和通量来探索各个细胞之间的差异，特别是在单细胞转录组水平。
将细胞培养板上的细胞放在显微镜下观察。表面上，它们都一样。实际上，它们一点都不相同。无论是DNA或RNA的水平，还是蛋白质或代谢物的水平，这些细胞相差甚远，而这些差异可能对细胞行为产生深远的影响。
多年来，研究人员一直缺乏工具，来高效拷问这些差异，不过今非昔比。有了新一代DNA测序仪和质谱仪，研究人员能够以更高的分辨率、深度和通量来探索各个细胞之间的差异，特别是在单细胞转录组水平。
单细胞捕获
目前，人们通常采用三种方法来分离单细胞。一种是荧光激活细胞分选（FACS），其中带有特定荧光标记的细胞才会激活荧光检测器。这些细胞随后进入收集板中，每个细胞占一个孔，而其余的细胞被丢弃。
据BDBiosciences的生物科学副总裁RobertBalderas介绍，FACS在单细胞分离上实现了其他方法的控制水平，这要归功于不同颜色带来的高分辨率。“这是一种二元的方法。如果有两种颜色和两种抗体，那么有四种可能性；如果是20种颜色，那么有220万个组合，”他说。
近，Broad研究院的LeviGarraway及其同事就采用了一种简单的方案，利用CD45的表达和细胞活力来分析人黑色素瘤中4645个肿瘤、免疫和基质细胞的转录组3。
BDBiosciences的款仪器，FACSymphonyA5细胞分析仪，提供了50个通道的分辨率（48种颜色再加正向和侧向散射），理论上有1.1万亿个组合。据Balderas介绍，目前研究人员已利用这个平台来区分30个通道，而40色的panel应该很快面世。
单细胞分离的另一种方法是显微操作，它利用玻璃微针，每次捕获一个细胞，并转移到目的容器中。这个过程可手动开展，或通过自动化系统开展，适合低复杂度的样品，但略显沉闷。
一个选择是微流体，比如Fluidigm的C1单细胞制备系统。与的Single-CellmRNASeqHT芯片相结合，C1可平行捕获800个细胞，并开展RNA分离和cDNA合成。这家公司的Polaris™系统也具有捕获、培养、刺激和制备样品的能力，可平行处理48个细胞，从而使研究人员能够探索单个细胞的功能。
文献中也经常报道新的微流体设计。今年1月，麻省理工学院的ScottManalis及其同事介绍了一种微流体“流体力学捕获芯片”，能够捕获和培养细胞；之后随着免疫细胞的生长和分裂，比较各代之间的转录变化1。
在分离出单个细胞后，研究人员可采用多种工具来定量基因表达水平。就目前而言，的也许是单细胞RNA-Seq，或者它的衍生形式–单核RNA-Seq，其中单个细胞核被分离出来并测序2。
下一步分析
10XGenomics公司近在BioRxiv预印本网站上介绍了一种特别高通量的RNA-Seq方法。它基于GemCode技术，可以对每个样品中数万个单细胞的3’mRNA进行计数。这家公司用它来分析68000个外周血单核细胞，并根据其转录特征来分级，检测到所有预期的细胞种类（如T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等）。
另一种流行的方法是单细胞qPCR。当然，研究人员也经常用RNA原位杂交及相关方法。AdvancedCellDiagnostics的医疗官RobMonroe认为，在验证RNA-Seq和PCR表达分析时，RNAISH特别有用，因为它在细节上的优势弥补了通量上的不足。
RNAISH“没有新一代测序的通量或多重分析能力”，Monroe说。“不过你获得的东西也同样重要：它们能够看到RNA在组织背景、细胞的形态学背景以及周围组织中的表达。”
AdvancedCellDiagnostics的RNAscope是一种新型的RNAISH技术。两条相邻的“Z探针”在特定转录本上杂交，为高度分支的检测探针树的组装提供了支架，这实现了信号放大。Monroe表示，单次结合可作为400个探针分子的支架，从而使信号放大400倍。利用显色试剂可拷问两个不同的RNA目标，而利用荧光试剂可拷问三个。
的华裔学者、哈佛大学的庄小威教授将RNAISH延伸到每个细胞中的1000个转录本。她的团队开发出一种名为MERFISH（多重容错荧光原位杂交）的方法，为每个转录本分配一个*的16位条形码，然后通过一系列杂交、成像和淬灭的步骤来读取4。
在一篇发表于《NatureMethods》的评论文章中，宾夕法尼亚大学的JimEberwine及其同事写道，“尽管单细胞测序让人们无比兴奋，但它仍不是一种常规的实验操作。基本技术以及数据分析和解释的改进对精确测定很重要，同时需要大样本量来了解单个细胞的作用”5。
其他的单细胞方法也是如此。随着文献中出现越来越多的改进，相信更多的研究人员会踏上单细胞分析之路。随之而来的，将是更多隐藏在大规模培养物背后的生物学秘密被揭开。
