欢迎使用询盘功能
- 请选择职务
- 采购员
- 经理/部门负责人
- 实验室管理者
- 学者
实时荧光定量PCR的优化（一）
深圳市安培生物科技有限公司
>> 进入商铺
2021/10/12 8:57:32
如果是病毒定量和SNP基因分型的实时荧光定量PCR，我们需要尽可能高特异性；如果是病原体、mRNA检测，我们需要高灵敏度。
想要提高PCR扩增效率、特异性及灵敏度，我们可以通过一系列措施优化实时荧光定量PCR实验。首先是靶序列的选择。
1、选择的靶序列合适长度在50～150bp之间。较短的序列合成耗时短，扩增时间缩短，因此污染DNA被扩增的可能性降低。2、选择靶序列时，使用BLAST检索分析靶序列是否存在多态性和测序错误，并避开。如果靶序列中出现重复序列，会降低PCR检测灵敏度，也应该避开。3、控制靶序列中GC含量≤60%。高GC含量，会影响靶序列在热循环中的变性，也容易产生非特异性扩增。4、避免产生二级结构。靶序列如果有反向重复的序列，容易产生二级结构，影响引物、探针的杂交。除此以外，我们还需要保证模板的质量不会影响扩增，实时荧光PCR的结果才有可靠性。例如损伤的DNA在PCR中不能充分扩增，或者根本不能扩增。同时，如果模板中存在抑制DNA聚合酶的试剂（DMSO等）和污染物（SDS等），也会影响PCR的可靠性。
