中性蛋白酶是最早用于工业生产的蛋白酶。大多数微生物中性蛋白酶是金属酶，酶蛋白中含有Zn2。相对分子质量35 000～40 000等电点(pI)8～9，是微生物蛋白酶中最不稳定的酶，很易自溶，即使在低温冰冻干燥，也会造成相对分子质量的明显减少。
代表性的中性蛋白酶是耐热解蛋白芽孢杆菌所产生的热解素与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的中性蛋白酶。这些酶在pH6～7稳定，超出此范嗣迅速失活。以酪蛋白为底物时，枯草芽孢杆菌蛋白酶最适pH为7～8，热解素是pH7～9，曲霉菌的酶是pH6.5～7.5。
一般中性蛋白酶的热稳定性较差。枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在pH7、60℃处理15min，失活90%;栖土曲霉(Aspergillus terricola)3.942中性蛋白酶55℃处理10min。失活80%以上;
而放线菌166中性蛋白酶的热稳定性更差，只在35。C以下稳定，45℃迅速失活。只有少数例外，如热解素在80。C处理1h，尚存酶活50%;
有的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，在pH7、65℃酶活几乎无损失。酶的最适温度取决于反应时间.在反应时间lO～30min内，最适温度45～50℃。钙离子可以增加酶的稳定性，并减少酶自溶，故中性蛋白酶提纯过程的每一步都需有钙离子的存在。
用合成底物实验表明，中性蛋白酶只水解由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等疏水大分子氨基酸提供氨基的肽键。对不同氨基酸构成的肽键的水解能力，因酶的来源而异，大体是亮氨酸>苯丙氨酸>酪氨酸。
工业生产中性蛋白酶常用的碳源是葡萄糖、淀粉、玉米粉、米糠、麸皮等，主要的氮源是豆饼粉、鱼粉、血粉、酵母、玉米浆等。在固体培养栖土曲霉3.942时，麸皮原料中掺加30%～40%废曲或酒糟，酶活可达15 000U/g以上。
