流式抗体的选择:
1、流式抗体本身也是抗体,所以选择流式抗体一定要满足抗体选择基本的条件:目标蛋白特异性,反应种属以及应用实验。
2、流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中,尽量减少实验工序和过程,以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内,建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。
3、流式抗体荧光标记的选择:如果实验中检测单一指标:不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。FACS Calibur仪器为例:PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5,通常来说,PE*,适用于弱表达抗原。FITC强度较弱,适用于强表达抗原,使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标:确认流式细胞仪能检测多少个通道:流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如:实验者同时检测三个指标,可以在图1中绿色、和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记,FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记,以防止荧光的重叠和相互干扰,影响后结果。因此,流式细胞仪的通道越多,同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。
同型对照的选择:流式抗体的选择使用注意事项:
1、建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响,因此需要优化试验条件。注:不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异,例如传统流式细胞术(采用鞘液流系统)需要1×106个细胞为起始上样量,抗体用量为10μl,而微流式细胞术则只需5×105个细胞,抗体用量减少到5μl。
2、 直标的流式抗体应该4℃避光保存,不要冷冻。