对硝基苯磷酸二钠用于酶联接免疫吸附剂测定和常规分光光度测定的碱性和酸性磷酸酶的非蛋白质性显色底物，是磷酸酯酶活性检测剂。
检测碱性磷酸酶是对硝基苯磷酸二钠最常见的应用。碱性磷酸酶广泛分布于人体各脏器中，而肝脏中的分布最为丰富。临床上，碱性磷酸酶用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查，因此对硝基苯磷酸二钠在肝胆相关疾病的诊断及辅助诊断中非常重要。
对硝基苯磷酸二钠作为碱性磷酸酶检测试剂的原理为：碱性溶液中无色的对硝基苯磷酸二钠可被碱性磷酸酶催化，出磷酸酰基，从而生产游离的对硝基苯酚（4-NP），对硝基苯酚在碱性溶液中转变为醌式结构，呈现较深的黄色。在波长405nm处检测吸光度增高速率，可计算出ALP的活性单位。
对硝基苯磷酸二钠还可用于水产品安全检测，用于制备腹泻性贝类毒素快速检测试剂盒。利用腹泻性贝类毒素在碱性条件下抑制PP2A酶催化无色底物对硝基苯磷酸二钠去磷酸化产生黄色产物对硝基苯酚的反应，根据pNP在405nm处吸光度与毒素浓度的剂量反应关系对毒素进行定量检测。
对硝基苯磷酸二钠还用于食用油及含油脂食品中邻苯二甲酸二丁酯的检测、农药残留检测、古文物汇中胶原蛋白的检测。同时，对硝基苯磷酸二钠也是医药、农药合成领域的重要化工中间体。
