实验动物的麻醉方法主要分全身麻醉和局部麻醉2大类。大多数的动物实验中，不仅是为了使动物免受痛苦，更为同时保护实验者免受伤害，通常需要对实验动物进行全身麻醉，因此所用的药物也绝大多数选用全身麻醉药。
全身麻醉主要包括吸入麻醉、注射麻醉和气管内插管麻醉。动物在全身麻醉前必须进行足以达到空腹的时间禁食和麻醉前1h禁水，不同种类的动物术前禁食时间不同，犬、猴、猪麻醉前禁食8～12h，豚鼠禁食12h，而兔和其他啮齿类动物不需禁食，大中型禽类(鸭、鸡、鹅)禁食6～12h。
1．吸入麻醉 吸入麻醉是将氟烷、甲氧氟烷等挥发性麻醉药，由动物经呼吸道吸入体内而产生麻醉效果。吸入麻醉通常适用于麻醉时间较短的动物实验或用作基础麻醉或注射麻醉的辅助麻醉方法，较容易控制麻醉深度、安全性好。各种实验动物如啮齿动物，包括犬、猴等大动物都可采用吸入麻醉。大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猫的吸入麻醉一般需借助麻醉罐进行，常用的麻醉罐大多为透明带盖的容器，大小根据动物体积而定，将动物放入含有吸附挥发性麻醉药的棉球或纱布的麻醉罐中，盖好盖子，观察动物的行为，动物即刻出现兴奋、继而出现抑制，随即自行倒下。猪、犬等大动物的吸入麻醉则需借助合适的麻醉口罩，将加上挥发性麻醉药的纱布置入口罩内。
2．注射麻醉 注射麻醉法是使用BBT类、LAT、水合氯醛、DXP和速眠新等非挥发性全身麻醉药注射入动物体内麻醉的方法。注射麻醉方法简便，麻醉时间较长，更适用于需较长时间麻醉的动物实验。注射可采用静脉注射、腹腔注射、肌内注射等途径进行麻醉。兔、猫、犬、猪、猴等大动物通常采用静脉注射或肌内注射的方法，而小鼠、大鼠、豚鼠等小动物则常采用腹腔注射的方法，大鼠还常采用尾静脉注射麻醉。在大动物的静脉注射麻醉时，不可将药物一次性快速推入，而是间歇、缓慢推注，达到预定剂量3／4后，更要减慢推注速度，并一边注射，一边观察动物的全身肌松程度，达到实验所需麻醉状态时，立即停止药物注射。
3．气管内插管麻醉 气管内插管麻醉是将一市售特制的导管置入动物气管内，建立人工通气管，通过这一气管内导管进行麻醉的方法。主要用于猪、犬等大动物需要长时间处于麻醉状态的实验中追加麻醉药物。此麻醉方法的优点主要在于适合任何手术体位要求，可防止麻醉后的动物因呼吸道阻塞而窒息死亡，使动物保持呼吸道通畅；可防止异物进入呼吸道，也便于清除气管内的分泌物；便于给氧吸入和辅助呼吸；能主动地对动物重要的生理功能指标进行监测、调整和控制。
局部麻醉虽然在动物实验中用途不是很广泛，但猫、犬等大动物短时间内实验中，在基础麻醉基础上可能会使用局部麻醉的方法，较多应用于眼科和耳鼻喉科的黏膜麻醉实验。局部麻醉是用局部麻醉药阻滞周围神经末梢或神经干、神经节、神经丛的冲动传导，产生局限性麻醉区，常用的方法有表面麻醉、浸润麻醉、区域阻滞麻醉以及传导麻醉等。局部麻醉对重要器官功能干扰轻微，麻醉并发症少，较之全身麻醉安全。局部麻醉药按化学结构分类，可划分为酯类和酰胺类2种局部麻醉药，酯类局部麻醉药有KKY、普鲁卡因、丁卡因和氯普鲁卡因；酰胺类局部麻醉药有LDKY、BBKY、卡博卡因和地布卡因等。
选择麻醉药物时还应考虑麻醉药物对实验结果的影响，有作者比较硫喷妥钠-异氟烷(TI)、美托咪定-(MK)和甲苯噻嗪-(XK)3种混合麻醉药物应用于相同的德国小型犬，在相同的实验室条件下观察视网膜电流图检测结果，发现硫喷妥钠-异氟烷明显干扰了波辐和峰潜时。
