作为 WB 的新手或老手，可能已经对 WB 实验要点了然于胸，例如，需使用新鲜样本，根据蛋白分子量选择合适孔径的转印膜，根据抗体选择适当的稀释液，根据 ECL 液灵敏度调整二抗稀释度等等。
但是，作为细节决定成败的实验，仍有几个极易被忽视的细节和问题。
Q1：什么是 WB 阳性对照？β-actin 难道不是阳性对照吗？
Q2：用什么裂解液裂解样本？
Q3：WB 需要超声吗？
Q4：对于磷酸化蛋白，封闭需要用 BSA 吗？
1）究竟什么是 WB 实验的阳性对照？为什么要设立阳性对照？
阳性对照（Positive Control）是已知或*有目的蛋白表达的样本。当对一个靶标并无检测经验时，在实验初期，强烈建议增加阳性对照帮助排查一系列问题，例如，待测样本中该靶标的表达量、操作步骤、抗体表现等。
而内参蛋白如 β-actin, GAPDH 等，一般在样本中高表达，作为管家蛋白而用来对比不同样本间的上样量 (Loading Control)，并非目的蛋白的阳性对照。
与阳性对照相对应的，还有阴性对照，即不表达靶标蛋白的样本。如图 1 所示，利用使用抑制剂或生长因子处理，制备针对 p-AKT(Ser473) 的阴性或阳性对照。
图 1：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（上）或 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691（下），对未经处理或经 LY294002/Wortmannin 处理的 PC-3 细胞、经血清饥饿或 PDGF 处理的 NIH/3T3 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
如何选择阳性对照？
a. 总蛋白的阳性对照
选用明确表达该蛋白的细胞或组织样本；可参考说明书示例图或数据库。如下图所示，Saos-2 细胞高表达 RUNX2，适宜作为阳性对照样本，而 LNCaP 细胞不表达该靶标。
图 2：使用 RUNX2 (D1L7F) Rabbit mAb #12556 和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457， 对 Saos-2 和 LNCaP 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
b. 翻译后修饰蛋白的阳性对照
并非所有的细胞都有基础的翻译后修饰水平（如磷酸化）的表达。如图 3 所示，不同的细胞 p-AKT(Ser473) 的基础水平差别非常大。有些靶标需要合适的刺激条件（包括诱导因子、剂量和时间窗）使蛋白获得修饰。您可查看说明书、阳性对照处理表，或者通过广泛阅读文献，了解处理方式，并结合预实验摸索条件。
图 3：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 检测不同样本中靶标的表达。
2）裂解样本用什么裂解液？
选择裂解液的考虑因素为样本种类：细胞，组织还是分离出的细胞组分。
对于全细胞裂解，建议使用 Cell Lysis Buffer（#9803）、RIPA 缓冲液（#9806）或 SDS 上样缓冲液 (#7722)。Cell Lysis Buffer 由于不含会使蛋白变性的强力去垢剂，仅含 1%Triton，使其可在多种实验中被使用（如 WB、IP）。RIPA 缓冲液含有 NP40 和脱氧胆酸钠，变性能力更强，可以裂解细胞或者组织。SDS 上样缓冲液也可以裂解细胞样本，但会干扰后续的 BCA 测定。
使用裂解液裂解时，需提前加入蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，以抑制内源性蛋白酶对细胞蛋白的降解和磷酸酶的去磷酸化作用。阅读裂解液说明书，来明确是否需要额外添加蛋白酶抑制剂（PMSF #8553 或 Protease Inhibitor Cocktail #5871）或者磷酸酶抑制剂（Phosphatase Inhibitor Cocktail #5870）。对于 Cell Lysis Buffer（#9803）、RIPA 缓冲液（#9806），仅需补充 PMSF 即可。
对于细胞组分分离，则可以通过组分分离试剂盒完成。Cell Fractionation Kit #9038 可方便快速的分离细胞组分用于下游分析，通过移液和离心的方式，分步获得细胞组分（图 4）。
图 4：使用 Cell Fractionation Kit #9038，对 HeLa 细胞的细胞组分进行蛋白质印迹分析，结果表明蛋白在细胞浆、细胞器/膜以及胞核/细胞骨架的定位。全细胞裂解物 (WCL) 表示总蛋白。细胞浆蛋白 (Cyto) 使用 CIB 缓冲液进行分离。膜和细胞器蛋白 (Mem) 使用 MIB 缓冲液进行分离。胞核和细胞骨架蛋白 (Nuc) 使用 CyNIB 缓冲液分离。
3）裂解后是否需要超声？
样本裂解后，建议进行超声。超声可以破坏膜结构，断裂 DNA，降低样本的粘稠度，让样本更加均质化，增加蛋白的溶解，提高实验结果的一致性。对于核蛋白或者膜相关蛋白，超声步骤尤为重要 (图 5)。
超声步骤为冰上 3 次 5 秒的超声（50% 输出功率），控制超声探头位置，避免产生气泡。如没有超声仪，可用 1 mL 注射器针头，冰上反复抽打裂解液 5~10 次，达到类似于超声的效果。
图 5：使用 Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody#9701 对超声或者未经超声处理的细胞裂解液进行检测
4）封闭：BSA 还是奶粉？
封闭的目的是减少由一抗或二抗的非特异性结合引起的背景。BSA 仅含有一种蛋白质，分子量为 60KD。而奶粉则含有多种蛋白质，所以封闭作用更佳（图 6）。
有文章指出奶粉中的磷酸酶可影响磷酸化信号，那磷酸化蛋白还能用牛奶吗？我们的回答：是的。二十余年的磷酸化蛋白抗体研发经验告诉我们，新鲜配置的牛奶不会对磷酸化信号产生任何影响，但随着牛奶储存时间的延长（即便在 4 ℃），就可能使磷酸化信号下降。且牛奶封闭更加全面，使得磷酸化靶标识别特异性更佳。
图 6：使用 Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb #13038，检测经 PDGF 处理的 3T3 细胞样本，BSA 封闭的结果中可见背景和杂带，而牛奶封闭的结果背景更干净，信号强且清晰。
封闭时使用 5% 脱脂奶粉-TBST，摇床上室温封闭 1 h。如后续使用荧光发光法，则封闭时不可含有 Tween® 20。二抗孵育时，也推荐用 5% 脱脂奶粉-TBST 稀释二抗，降低背景。注意，需使用实验级脱脂奶粉（Nonfat Dry Milk #9999），食品级奶粉不可用于实验。
