猴的肿瘤坏死因子α（TNFα）酶联免疫吸附测定试剂盒
使用说明书
产品编号：E0133Si
规格：96T
本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断!
预期应用
本酶联免疫吸附测定试剂盒运用双抗体夹心ELISA法定量测定猴血清、血浆或其它相关生物液体中TNFa含量。
本试剂盒未提供但需自备的设备及试剂
1、450±10nm滤光片的酶标仪（建议仪器使用前提前预热）
2、单道和多道微量加液器及吸头
3、稀释样品的EP管
4、蒸馏水或去离子水
5、吸水纸
6、盛放洗液的容器
| 本试剂盒已提供的试剂 试剂名称 | 数量 |
| 96孔板（预包被） | 1 |
| 标准品 （冻干） | 2 |
| 标准品稀释液 | 1 × 20ml |
| 检测溶液A | 1 × 120μl |
| 检测溶液B | 1 × 120μl |
| 检测稀释液A（2 x） | 1 × 6ml |
| 检测稀释液B（2 x） | 1 × 6ml |
| TMB底物 | 1 × 9ml |
| 终止液 | 1 × 6ml |
| 浓洗涤液（30 x） | 1 × 20ml |
| 96孔板覆膜 | 4 |
| 使用说明书 | 1 |
试剂盒的储存及有效期
所有试剂均按试剂瓶标签上所示保存。请注意，收到试剂盒后请尽快将标准品、检测溶液A、检测溶液B以及96孔板保存于-20。开封后的酶标板要密封加干燥剂后保存于-20，避免潮湿。有效期为6个月。
实验原理
将TNFa抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中依次加入标准品和标本，其中的TNFa与连接于固相载体上的抗体结合，洗板之后加入生物素化的TNFa抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次*洗涤后加入底物（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的TNFa呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度。
标本的采集与保存
1、 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置30分钟或4过夜，然后1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
2、 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2 - 8 1000g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
3、 其它生物标本：请1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
注意：
以上标本均需密封保存，4保存应小于1周，-20不应超过1个月，-80不应超
过2个月。
2、 标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。
3、 标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
试剂准备
1、 使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温（18-25），试剂不能直接在37溶解。
2、 标准品（冻干品）：每瓶标准品用标准品稀释液稀释至1mL，盖好后室温静置大约10
分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2,000 pg/mL。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入500的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成2,000 pg/mL，1,000 pg/mL，500 pg/mL，250 pg/mL，125 pg/mL，62.5 pg/mL，31.2 pg/mL，标准品稀释液（0 pg/mL）直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
Tube 1 2 3 4 5 6 7 8
pg/mL 2,000 1,000 500 250 125 62.5 31.2 0
3、 检测稀释液A及检测稀释液B：用6mL蒸馏水或去离子水将6mL浓检测液A及B稀释至12mL，进行2倍稀释，稀释后的工作液不宜进行冷冻保存。
4、 检测溶液A及检测溶液B：Detection A 及Detection B在使用前请手甩几下或少时
离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B
1:100稀释（如：10 检测溶液A / 990检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预
先计算好的每次实验所需的总量配制（100/孔），实际配制时应多配制 0.1-0.2mL。
5、 浓洗涤液：用580mL蒸馏水或去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL，进行30倍稀释。
6、 底物溶液：请用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的TMB至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回TMB瓶中。
注意：
1、 标准品请于临用前15分钟内配制。该标准品只能使用一次。
2、 标准品的稀释不能直接在板中进行。
3、 标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请使用相应的稀释液配制，不能混
淆。混匀时要轻轻充分混匀，避免起泡。为保证实验结果的准确请使用微量吸管，并
校准微量加液器。请依据所需的量配制，尽量不要微量配制（如吸取检测溶液A
时，一次不要小于10），以避免造成浓度误差。
4、 请勿重复使用已经稀释过的标准品、检测溶液A工作液和检测溶液B工作液。
5、 浓洗涤液中如有结晶析出，请先温育至室温，轻轻混匀，至到结晶*溶解再进行配制。
操作步骤
实验前应预测标本含量，如果标本浓度过高，应对标本进行稀释，使稀释后的标本符 合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、 加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100 不同
浓度的标准品（见试剂准备2）。空白孔加 100 （见试剂准备第二步zui后一管），余孔加待测样品100，酶标板加上覆膜，37温育2小时。
2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。
3、 每孔加检测溶液A工作液 100（临用前配制），酶标板加上覆膜，37温育1小时。
4、 弃去孔内液体，每孔用400 的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干），重复洗板 3次。zui后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液*甩干。
5、 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100，加上覆膜，37温育30分钟。
6、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。
7、 每孔加底物溶液90，酶标板加上覆膜，37避光显色（反应时间控制在15-25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明
显时，即可终止）。
8、 每孔加终止溶液50，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动 酶标板以使溶液混合均匀。
9、 在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（值）。
注意：
1、 试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。
2、 加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间（包括标准品及所有样品）控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3、 温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4、 洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液*甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响zui后的酶标仪读数。
5、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟观察一次），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
6、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
洗板方法
1、 手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4mL注入孔内，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；根据需要，重复此过程数次。
2、 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
各标准品及样本 值扣除空白孔 值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线（*方程式应依回归方程计算的R2值来定，以R2值越趋近于1为好）。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如 curve expert 1.3，根据样品值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
检测范围：31.2 pg/mL - 2,000 pg/mL
zui低检测限：7.5 pg/mL
此值为20个空白样品（即标准品稀释液）测定的平均值加三倍标准差所对应的浓度。
特异性
本试剂盒用于检测猴的TNFa，灵敏度高，特异性好，且与其它相关蛋白无明显交叉反应。
说明
1、 由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定
与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。
2、 zui终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，
请务必准备充足的标本备份。
3、 本试剂盒不能排除标本中可能含有的可溶性受体，配体，结合蛋白和其它相关因子对
实验所产生的干扰。
4、 只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到*的检测结果。
5、 在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和微
生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
6、 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任
何影响。请勿提前将酶标板从包装袋里拿出。
7、 本试剂盒有效期：六个月。
8、 请使用配备有450±10nm滤光片的酶标仪，且该酶标仪测量范围在0.001-3.000 或以上。
9、 本操作说明同样适用于48T试剂盒，但48T试剂盒所有试剂减半。
警告
本试剂盒中使用硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。
