盐酸克仑特罗（ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ,ＣＬ）,又名氨哮素、瘦肉精、双氯醇胺等,化学名为α [（叔丁氨基）甲基] 4 氨基 3,5 二氯苯甲醇盐酸盐,是一种β2 受体激动药。其松弛支气管平滑肌作用强而持久,临床上主要用于治疗支气管哮喘。由于药物半衰期长,在体内代谢慢,临床应用时,可能出现肌肉震颤、心慌、心悸、头疼、恶心、呕吐等症状,特别是对于高血压、心脏病、甲亢、青光眼、前列腺肥大等疾病患者危险性较大,可能会加重病情,导致意外,所以对ＣＬ的临床血药浓度监测非常重要。本实验采用ＨＰＬＣ-电化学法测定ＣＬ血药浓度,参考有关资料,着重对人血浆中ＣＬ的提取方法、色谱条件、内标物质的选择以及方法的准确性和重现性等进行了研究,并对患者血浆样本进行分析。
1材料
1.1仪器
岛津ＬＣ 6Ａ液相色谱仪,ＬＥＤ 6Ａ电化学检测器,ＪＳ 3030色谱工作站,超声波仪,恒温水浴箱（上海和呈仪器生产）,高速离心机。
1.2药品与试剂
盐酸克仑特罗对照品（新乡同心制药厂,批号20030601,纯度98.7%）,乙腈（色谱纯）,辛基磺酸钠（Ｓｉｇｍａ）,其余试剂均为分析纯。ＣＬ对照品和对苯二酚内标均用0.02ｍｏｌ?Ｌ-1ＨＣｌ配制成标准储备液。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱:ＮｕｃｌｅｏｄｕｒＣ18（250ｍｍ×4.6ｍｍ,10μｍ）;流动相:磷酸二氢钾缓冲液-乙腈=7∶3（Ｖ/Ｖ）;磷酸二氢钾缓冲液内含0.02ｍｏｌ?Ｌ-1磷酸二氢钾,0.15ｍｍｏｌ?Ｌ-1Ｎａ2ＥＤＴＡ,0.2ｍｍｏｌ?Ｌ-1辛基磺酸钠,ｐＨ5.0,并通过0.45μｍ的滤膜过滤后与乙腈按比例混合,流速1.2ｍＬ?ｍｉｎ-1,检测器电位0.80Ｖ（Ａｇ/ＡｇＣｌ电极）,进样量20μＬ。
2.2血浆样本的处理
取15ｍＬ离心试管依次加入0.2ｍｏｌ?Ｌ-1ＮａＯＨ溶液2ｍＬ,0.5ｍｇ?Ｌ-1对苯二酚内标液100μＬ,肝素抗凝血浆样本1ｍＬ,混匀,加乙醚-乙醇（8∶2）提取液8ｍＬ,封盖,用超声波仪提取20ｍｉｎ,3000ｒ?ｍｉｎ-1离心15ｍｉｎ;取上清液转移至另一洁净试管中,加入0 .2ｍｏｌ?Ｌ-1ＮａＯＨ2ｍＬ混匀洗涤,3000ｒ?ｍｉｎ-1离心5ｍｉｎ,取上清液层转移至一洁净试管中,置60℃水浴上通Ｎ2挥干,残留用0.1ｍＬ流动相重组后,取20μＬ供液相色谱仪测定,用内标法以峰面积定量。
2.3系统适应性试验
通过对流动相的配比、ｐＨ、流速、检测电位的调整实验,确定在上述色谱条件下,空白血浆加内标及ＣＬ对照品的测试结果见图1。内标及ＣＬ保留时间分别为4.975、5.652ｍｉｎ。两者分离度>5,达到基线分离,且无空白干扰。
2.4标准曲线的绘制
取空白血浆7份,每份1ｍＬ,各加入100μＬ内标液,分别加入适量标准溶液使之配成5、10、20、40、60、100、120μｇ?Ｌ-1的标准系列;按2.2项下操作测定,由色谱工作站直接求出ＣＬ对内标的峰面积比值（Ｙ）与相应的浓度比值（Ｘ）的回归方程,Ｙ=0.753Ｘ+0.011,ｒ=0.9993。检出限为0.015μｇ?Ｌ-1（ｒＳＮ=3）,线性范围为1.5～120μｇ?Ｌ-1。
2.5回收率和精密度的测定
对高、中、低3份ＣＬ含量为5、20、40μｇ?Ｌ-1的标准血样分别按本法检测,其回收率分别为90.5%、94.7%、96.3%,平均为93.8%。同时3份样本按本法分别平行检测5次,ＲＳＤ分别为2.6%、3.7%、4.2%。
2.6样品测定
我们采用该方法测定了3例患者口服ＣＬ后的血药浓度,患者每次口服该药30μｇ,服药后2.5ｈ和24ｈ静脉取血。结果见表1。
3讨论
国内外文献报道的ＨＰＬＣ法测定生物样本ＣＬ的前处理方法中,采用乙醚-丁醇、己烷-乙酸乙酯等溶剂体系,提取回收率均偏低,影响检测灵敏度。因为盐酸克仑特罗在中性、酸性下易溶于水、甲醇、乙醇,不溶于乙醚等,而在碱性下可溶于乙醚。本实验在碱性条件下用乙醚∶乙醇混合比分别为6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的4种混合提取液对同一份加标样品,各作3次平行对比测定。其平均回收率分别90.6%、92.2%、95.3%、93.6%。结果表明乙醚∶乙醇混合比8∶2作提取液时,其结果*。
本法处理样品简单,测定准确、快速,采用电化学检测器检测,专属性强,灵敏度高,且不受其他药物的干扰,更适用于临床盐酸克仑特罗血药浓度的监测。
