超分辨高精度显微镜3D成像模块
光学显微镜凭借其非接触、无损伤等优点，成为生物学家研究细胞功能结构、蛋白网络结构、DNA等遗传物质、细胞器以及膜结构等应用不可少的工具，然而衍射极限的存在，使得人们无法清晰地观察到横向尺寸小于200nm、轴向尺寸小于500nm的细胞结构。二十一世纪初期，具有纳米尺度分辨率的超分辨光学显微成像技术的出现，使得研究人员可以在更高的分辨率水平进行生物研究。在超分辨显微技术飞速发展的同时，现有成像技术的缺陷也日益显现，例如成像分辨率和成像时间不可兼得；对透镜制造技术提出了一定要求的同时，也限制了观测的视野；日益复杂的设备使得操作和维护也越来越困难等。
为解决上述问题,美国Double Helix Optics公司提出了纳米级分辨率成像的新概念-“SPINDLE”，不仅突破了衍射极限，还可以实现三维成像，可捕捉到小至横向尺寸10 nm、轴向尺寸15 nm的细节。在该技术中，SPINDLE模块被安装在显微镜和ccd或相机之间，无需改变现有成像系统设置。基于特殊设计的相位掩模版，从工程化点扩散函数 (E-PSF)出发，使用螺旋相位掩模板来控制景深、发射波长和精度，结合3DTRAX软件对3D图像进行重建和分析，可在不需要扫描的条件下即时捕获 3D 信息，得到深度和精度3D图像，横向精度可达20nm, 轴向精度可达25nm，成像深度可达20um。当与其他工具和技术，包括STORM、PALM、SOFI、光片显微、宽场、宽场显微、TIRF、FRET等一起使用时，可释放巨大的潜力，适用于活细胞、固定细胞和全细胞成像、单分子、粒子跟踪和粒子计数等应用。
图1：SPINDLE2双通道显微镜模块，用于同时多色、多深度3D成像
SPINDLE2可以被很容易地安装到现有显微镜和CCD或相机之间，内置旁路模式可轻松返回到非3D光路，是实现单发超分辨和3D宽场成像的理想解决方案。
图2：非洲绿猴肾细胞的3D 图像，微管和肌动蛋白分别标记，两种颜色同时成像
在SPINDLE模块中，最核心的是经过特殊设计的相位掩模板，其尺寸和设计需和光学系统和成像条件相匹配。这些相位掩模板将单一物体发出的光分裂成两个独立的旋转的光瓣，类似于双螺旋。两瓣的中点对应物体发光源的横向位置，两瓣的夹角对应发光源的轴向位置。由于旋转180°时光斑可以保持聚焦，因此可以高精度地获取发光“点”的深度信息。收集的数据由许多这些在不同方向上与物体横向和轴向位置相对应的分离良好的点组成。经过对这些详细的目标点数据集处理和图像重建创建，即可得到超高分辨率原始物体清晰的三维结构。
图3：工程化相位掩模板通过每帧成像更大的体积来节省时间和存储空间，并降低感光度
丰富多样的相位掩模板库，包括双螺旋，单螺旋，EDOF，四足，和多色设计以提供最大的控制和灵活性。用户可依据深度范围、波长和其他光学参数选择合适的相位掩模版以满足最佳的深度-精度平衡。
3DTRAX® 软件用于计算每个粒子的z位置，运行专有算法以自动进行3D定位，以‹20 nm的深度和分辨率渲染高精度3D图像，用于单分子定位和跟踪。对漂移进行自动校正并生成直观的绘图，同时保持高数据质量。
图4：3DTRAX®是非常易于使用的斐济插件
使用适用于 Windows、MacOS 和 Linux 的库集成到您的工作流程或 OEM 仪器中，以 ThunderSTORM 或双螺旋文件格式保存图像并导出文件以供进一步分析，专有的反卷积算法可以在不损失精度的情况下重建全细胞图像。
图5：从左到右：非洲绿猴肾细胞的细胞骨架，小鼠胚胎成纤维细胞中的微管，小鼠胚胎成纤维细胞细胞核中的复制DNA的3D超分辨图像
超分辨显微镜3D成像模块应用
超分辨显微成像和3D粒子跟踪技术为生物学和生物医学研究、药物发现、材料科学研究和工业检测打开了一个充满可能性的新世界。双螺旋工程技术具有高达传统显微镜30倍的成像深度，其为超分辨成像带来精度-深度平衡。在3D粒子追踪应用中，双螺旋工程带来的扩展的深度可以实现更长粒子轨迹的捕获。
在生命科学领域，双螺旋光工程正在从癌症和免疫学到传染病和神经科学的生命科学的突破。研究人员通过使用SPINDLE模块发现了新的细胞结构和亚细胞的相互作用。研究神经退行性疾病的科学家们能够看到以前从未见过的压力颗粒核3D图像。同样，研究免疫学的研究人员已经能够重建整个T细胞。
在药物开发领域，研究人员已经可以看到和跟踪药物化合物的真正工作原理，而不是简单地模拟新的化合物。双螺旋光工程实现了在成像和单粒子跟踪(SPT)领域的新突破，随着追踪分子的能力跨越更大的景深（高达20um），双螺旋可以记录比以往任何时候更长的轨迹，使得识别先导化合物和加快药物发现变得更加容易。
在材料科学领域，借助3D纳米成像和粒子跟踪技术，无论是金属、半导体、陶瓷、聚合物还是纳米材料研究，双螺旋技术都可以让您看到材料的结构、流动性等性能。精密成像与深度扩展相结合，让你对粒子动力学有了新的认识。有了更多的数据，就可以更好地预测材料在任何给定应用领域中的性能。
在工业检测领域，双螺旋工程可实现纳米尺度的三维检查。现在你可以在从微芯片到像素级的产品中发现微小的缺陷和其他功能缺陷。纳米级精度的检测，可以提高质量控制，节省时间，降低成本，提高产量和跟踪质量。
引文：[1]金录嘉, 何洋, 瞿璐茜,等. 新型超分辨显微技术的最新研究进展[J]. 光电产品与资讯, 2018, 9(3).
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相关文献：
(1)Anastasiia Misiura, et. al., “Single-Molecule Dynamics Reflect IgG Conformational Changes Associated with Ion-Exchange Chromatography,” Analytical Chem., 2021
(2)Laura Hoppe Alvarez, et. al., “Controlling microgel deformation via deposition method and surface functionalization of solid supports,”
Phys. Chem. Chem. Phys., 2021,23, 4927-4934
(3)Xilin Yang, et. al., “Deep-Learning-Based Virtual Refocusing of Images Using an Engineered Point-Spread Function,” ACS Photonics, 8, 7, 2174–2182, June 2021
(4)Anish R. Roy, et. al., “Exploring cell surface-nanopillar interactions with 3D super-resolution microscopy,” BioRxiv, June 2021S. Li, J. Wu, H. Li, D. Lin, B. Yu, and J. Qu, “Rapid 3D image scanning microscopy with multi-spot excitation and double-helix point spread function detection,” Optics Express, vol. 26, no. 18, p. 23585, 2018.
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