通过化学发光免疫实验检测 IgG 抗体

简介
作为novel coronavirus免疫反应的一部分，感染者体内会产生病毒特异性抗体，在出现症状后的一至三周内，这些抗体可以在血液中被检测到。IgG 和 IgM 几乎同时出现，而 IgG 在更长时间内维持一个高水平。在血清中，由于感染病毒或接种疫苗而产生的可检测到的抗体可以防范将来被novel coronavirus感染。但这些抗体持续的时间长短和提供保护的程度是有关novel coronavirus仍需密切调查的众多问题之一。

在人体血清中，通过免疫实验来检测novel coronavirus抗体是增进我们了解 这种疾病以及疫苗研究的重要工具。Promega LumitTMDx SARS-CoV-2 免疫实验使用了带有SmBiT 和 LgBiT ( 这是 NanoLuc 荧光素酶的两个亚基，只有当它们通过结合相互靠近时，才具有功能 ) 标记的novel coronavirus刺突蛋白受体结合区域(RBD) 的一个片段。当这些标记过的病毒蛋白片段与含有novel coronavirus抗体的样品一起孵育时，他们将与抗体结合，将 SmBiT和 LgBiT 两个亚基结合到一起，并产生功能性的荧光素酶。添加 Lumit 检测试剂，在微孔板光度计上测量产生的荧光信号。

Lumit 实验中，样品的添加和测读如图 1 所示。没有清洗的步骤并且一小时内测得结果，使得这个实验可以应用于高通量筛选。SpectraMax iD5 多功能酶标仪具有超冷光电倍增管(PMT)，可以为 Lumit Dx

novel coronavirus免疫实验提供高灵敏度的发光检测。

优点
• 放大高通量筛选，省去清洗步骤，

• 样品体积仅需 15 微升，

• 一小时内测得结果。

材料
• Lumit Dx novel coronavirus免疫实验试剂盒 (Promega cat. #VB1080)

•

novel coronavirus阳性血清样品 (BioIVT cat. #HMSRM-COVID)

• 正常人血清 (Amsbio cat. #HSER-2mL)

• 白色 96 孔板 (Greiner cat. #655075)

• SpectraMax iD5 多功能酶标仪 ( 美谷分子仪器 )

方法实验试剂的准备和微孔板的操作如下 ( 更多的细节， 请参阅Lumit Dx novel coronavirus免疫实验技术手册 )：

1. 制 备 1x Lumit-Dx 免 疫 实 验 稀 释 缓 冲 液 ( 添 加 5mL 10xLumit-Dx 免 疫 实 验 稀 释 缓 冲 液 至 45 mL Lumit-Dx PBS/

EGTA 溶液中 )。

2. 来源于

novel coronavirus患者或健康受试者的 30 uL 血清样本， 与 70 uL1x Lumit-Dx 免疫实验稀释缓冲液混合。 有足够的体积进行三次实验； 通常每个孔仅需 15 uL 样品。

3. Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 现 配 现 用， 配 方 如 下：5mL 1x Lumit-Dx 免疫实验稀释缓冲液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 红色盖子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 蓝色盖子 )。添加完毕后，轻微地颠倒混匀。

4. Lumit-Dx 阳性对照、Lumit-Dx 阴性对照、Lumit-Dx 实验校准试剂， 解冻后放置于室温及时使用。简短的离心可使管壁内容物甩至管底。

5. 按如下操作， 添加试剂至白色 96 孔板中：

• 每个孔加入 40uL Lumit CoV-2 BiTs Master Mix，

• 20uL 稀释的病人血清样本， 三个重复，

• 20uL Lumit-Dx 阳性对照，三个重复，

• 20uL Lumit-Dx 阴性对照，三个重复，

• 20uL Lumit-Dx 实验校准试剂，三个重复，

6. 将微孔板封盖，室温孵育 20 分钟。

7. 孵育后，制备 Lumit-Dx 检测试剂 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫实验稀释缓冲液、230 uL Lumit-Dx 检测底物 ( 灰色盖子 )，现配现用。 轻微地颠倒混匀。

8. 60 uL 检测试剂加入孔中，室温孵育 3 分钟。

9. 使用 SpectraMax iD5 读板机测读，如表 1 所设置。 测读完成后，相对发光单位 (RLUs) 显示在 SoftMax Pro 软件的plate 板块中。在模板中，这些孔被分配到不同的组中，各组产生的表单被用于计算和显示数据结果。实验的质控按照试剂盒技术手册进行评估。 Lumit-Dx 实验校准试剂、Lumit-Dx 阳性对照、Lumit-Dx 阴性对照都被用于确保最合适的实验性能。相比于 Lumit-Dx 实验校准试剂，阳性对照必须产生更高的相对发光单位值，阴性对照必须产生更低的相对发光单位值。如果这些条件不满足，微孔板测读结果将是无效的。