高效液相色谱仪主要有：进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。
1.进样系统
一般采用：隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。
2.输液系统
该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47～4.4×107Pa流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、pH值或改用。
3.分离系统
该系统包括：色谱柱、连接管和恒温器等。
色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管）内径为2～5mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成），固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如，硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样）或者用化学法偶联各种基因（如，磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。
因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性，例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。
另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小、微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。
这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60℃通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。
4.检测系统
高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种：
(1)紫外检测器
该检测器适用于对紫外光(或可见光)有吸收性能样品的检测。
其特点：使用面广（如，蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g/mL）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。
(2)示差折光检测器
凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测；糖类化合物的检测使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但是，灵敏度低（检测下限为10-7g/mL），流动相的变化会引起折光率的变化；因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。
(3)荧光检测器
凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如，多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g/mL）痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。
5.数据处理系统
该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
