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明胶酶谱试剂盒现货供应!

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2022/4/13 10:59:20

明胶酶谱试剂盒现货供应!

产品描述:

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌,活化后能够降解 细胞外基质的胶原蛋白,友称胶原酶。通过影响细胞外基质,胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组 织重塑等过程,并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的 MMP-2、MMP-9 参与各种生理与病理过程,其在研究诊断和治疗中的意义日益受到重视。

本试剂盒采用酶谱法(zymography)检测 MMP-2、MMP-9  活性。Zymography  是一种广为使用的、基 于 SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法,其灵敏度可达 1 nM,高于 ELISA 方法 2,其 基 本原理和程序是:制备加有胶原酶底物的 SDS-PAGE 凝胶,含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电 泳, 电泳结束后取出凝胶与酶反应 Buffer 孵育,凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深 染,形 成深色背景,但在有蛋白酶条带的位置,蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白,因而不被染色 而形成透 亮区域,从而能同时指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学反应缓冲液,可检测少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶谱及活性,检 测灵敏度~1 nM。试剂盒可进行 50 次标准小胶检测,如果小胶加样孔为 10~15个,则总计可检测 500~750 个样品。

产品组成:

1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, 20 ºC;
2.10 × Substrate G, 50 ml, 20 ºC;
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释;

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释;

5. SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液, 4 ºC。

实验步骤(仅供参考)

1. 制备含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝胶:推荐分离胶浓度为 8%。按照标准程序制备 SDS- PAGE 凝胶。将 10 × substrate G 融化,并 90 ºC 加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加 入 10 × substrate G 并使之稀释 10 倍,混匀后加入过硫酸铵和 TEMED,等待凝胶聚合。

2. 待测样品 1:1 稀释于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上样。切勿加热变性,并且仅 使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量,使用普通蛋白预染  Marker 即可。阳 性对照(可选步骤):可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血与 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等体积混合,取 5-15µl 上样。

3. 低电流恒流电泳,每一块小胶电流为 20mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4. 洗涤凝胶:取出凝胶,去除浓缩胶,放入容器内.可先用适量蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10ml

1× Buffer A(用蒸馏水稀释),室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。

5.  孵育:倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释),室温或 37ºC 孵育 1~5 小时。阳性 对 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小时即可显示。如 MMP 活性低,应延长孵育时间为 10 小时或 过一夜。

6.  显色:倒掉 Buffer B,加入 SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(操作步骤见 SDS-PAGE 凝 胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书)。凝胶的大部分区域被深染,在有 MMP 条带的位置 不被染 色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及 活性。阳 性对照将在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出现透明条带。

7. 条带扫描:将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 MMP 条带透明,但凝胶背景并非真正全黑。解决 办法:可用非透射光扫描,或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示,并尽量设置为黑色.MMP条带则为白色,这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。

本产品仅供科研实验用,不做其它用途!



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