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2022/4/26 10:24:19细节决定western blot的结果
细节决定成败,western blot更是如此,那让我一一为大家介绍这些细节的地方吧。
一、 样品准备部分
有好的开始,才会有好的结果。良好的样品的制备,是WB的重中之重,特别是以下几个方面:
1. 时间把控到位
尽管样品的处理浓度可能不同,处理时间也可能不同,无论是孵育的时间还是终止的时间,都要按照预先设计的时间来进行,提前或者推迟,都会影响最终的结果。
2. 防止蛋白降解
防止蛋白降解的方法通常有两种:
(1)低温操作
所有的用具、样品、裂解液等都提前预冷,实验全程在低温(4℃)下操作,可以有效防止蛋白讲解
(2)蛋白酶抑制剂
将蛋白酶抑制剂和PMSF共同使用,能有效防止蛋白降解。
3. 裂解液用量把控精确
裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。若裂解液量较少,就会导致蛋白浓度太高,与上样缓冲液反应不充分,电泳后会出现多条条带,条带形状也不好;若裂解液量过多,蛋白浓度被稀释,会导致在胶孔中的上样量不足,条带不清晰。
有了好的开端,再加上好的过程,势必会有好的结果。WB过程中需要注意的细节如下:
1. 制胶
Biorad的制胶试剂盒,让制胶的日子洒满了阳光。
2. 上样
实验不同,上样的总蛋白量稍有不同。若上样体积小的,可用枪头直接上样;若上样体积>20ul,建议采用微量注射器;若上样体积太大,可采取间断上样。
3. 电泳
样品到达分离胶之前,控制电压≤60V,能有效解决样品排列不整齐的问题。样品到达分离胶之后,可调节电压为100V,若时间充足,维持电压在60V以下,效果更好。
4. 转膜
电泳开始后就配置电转液,加入甲醇,预冷。预冷是神助。
我们的实验,有了上述的神助攻的细节,期待你的结果吧。