概述
体内细胞不断受到多种微环境对细胞功能的机械刺激的调节。虽然前人已经建立了二维细胞对机械刺激的反应模型，但这些方法缺乏相关性，因为生理细胞微环境是三维的。此外，现有的用于研究细胞对三维机械线索的反应的平台要么提供低通量，涉及复杂的制造，要么不允许对多个线索进行组合分析。考虑到这一点，提出了一种可拉伸的高通量(HT)三维细胞微阵列平台，该平台可以将动态机械应变应用于封装在排列的三维微凝胶中的细胞。该平台使用生物打印技术，在周期性拉伸的弹性复合基底上打印含细胞的甲基丙烯酸明胶(GelMA)微凝胶阵列。所开发的平台具有高度的生物相容性，并将所应用的细胞从拉伸的底物转移到细胞中。HT分析用于分析整个打印微凝胶阵列的细胞机械反应。并对不同的细胞行为进行了组合分析。
1，介绍
体内细胞不断受到多种微环境刺激，包括生化信号、生物力学场、细胞外基质(ECM)或底物刚度，以及细胞相互作用。细胞的命运、功能和反应是受到所有这些微环境线索对细胞的联合效应的高度调节。细胞对单个微环境因子的反应已被各种研究很好地描述出来。然而，这些因素之间存在相互作用（同时调节细胞功能），因此评估细胞对多种微环境线索的协同效应的反应将受益于组合和高通量(HT)方法。
细胞微阵列作为HT平台之一，允许对多种微环境信号的细胞行为进行快速、多重的研究。大多数平台主要集中在筛选可溶性生化因子和ECM蛋白，只有少数存在筛选机械刺激，这中机械刺激是非常重要的，因为细胞在体内意义和响应各种机械刺激通过机械转导。例如，在血管系统中，内皮细胞同时经历剪切应力和剪切应变，平滑肌细胞同时经历周向拉伸拉伸和压缩应变。此外，心脏和肺中的细胞暴露在拉伸应力和应变下，而骨和软骨组织中的细胞则受到压缩应力-应变的影响。
一些用于筛选细胞机械反应的细胞微阵列平台已经被开发出来，认识到细胞机械刺激在调节许多组织的发育和病理条件中的重要性。这些平台的初版本能够评估2D细胞培养的机械反应。然而，这种方法缺乏生理相关性，因为3D的细胞行为与2D的*不同。由于这个原因，我们开发了能够为细胞创造3D环境的平台。功能水凝胶由于具有高度的生物相容性和支持细胞生长，已被广泛应用于组织工程应用。3D微环境是通过将细胞封装在功能性水凝胶支架中，并将其作为为阵列，然后在培养过程中引入刺激。然而，目前只有少数平台证明了拥有筛选3D细胞对机械刺激的反应的能力。Moraes等人设计了一个应用不同压力到凝胶阵列的微流控平台。类似地，Liu等人开发了一种微制造平台，通过对充满细胞的聚乙二醇水凝胶阵列施加动态拉伸应变，可以对细胞进行三维机械刺激。近，Li等人展示了一种阵列平台，可以磁性驱动暴露在极限静态拉伸应变下的细胞内甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)水凝胶。尽管他们在评估3D细胞对机械应力和应变的反应方面采用了创新的方法，但这不允许筛选细胞对其他微环境刺激的综合反应，认为这是一个低通量系统。Seo等人报道了一种可相互连接的生物反应器，该反应器允许HT筛选连续介质灌注下的凝胶凝胶水凝胶成分和动态压缩应变对干细胞成骨分化的组合效应。虽然这个平台允许HT研究多种线索对细胞的联合影响，但它涉及到复杂而费力的制造过程。此外，带图案的细胞式水凝胶是毫米级的，因此需要大量的水凝胶。此外，本研究的结果显示，干细胞的成骨分化增强，没有显示出任何其他细胞向拉伸方向的行为，这是外部机械刺激作用细胞时常见的观察。
在本文中，我们报道了一个可伸缩的三维细胞微阵列平台，具有简单的制造步骤和提高的吞吐量容量。所开发的平台是由三维生物打印成纤维细胞负载的GelMA微凝胶阵列结合在弹性复合膜基质上组成。使用定制的单轴动态拉伸器对平台进行动态单轴拉伸，以研究细胞对机械应变的响应。研究了该平台的生物相容性因素，如细胞活力、扩散和增殖等。作为概念的证明，与非拉伸对照组相比，使用细胞成像技术表征了细胞对动态机械拉伸的反应。在开发的平台上打印不同浓度的成纤维细胞GelMA微凝胶，对不同细胞微环境对机械刺激进行组合分析。在对照组和拉伸组中，分析了单个水凝胶浓度下的细胞扩散和取向。可伸缩微阵列平台使细胞以HT方式机械刺激，也促进了细胞机械反应的组合筛选。该平台还可以扩大规模，引入广泛的细胞外线索，并以HT的方式筛选细胞反应和3D组织的形成。我们相信，所开发的平台将为筛选各种生物材料参数提供一个很有前途的解决方案，用于细胞生长和调节细胞功能（特别是干细胞分化），以模拟更现实的生理环境。
2.平台制备（略）
3.不同浓度和硬度细胞微阵列打印和培养（略）
4.拉伸测试（略）
5实验结果分析
6 结论
动态应变响应细胞排列的机制
一些细胞类型，特别是收缩细胞(包括成纤维细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和人间充质干细胞(hMSCs))，已经证明能对外部动态刺激作出反应。一般来说，当暴露于静态或动态拉伸时，3D水凝胶中的细胞与拉伸轴对齐。当我们的平台以1hz的频率以10%的应变率拉伸3天时，6%GelMA芯片内的细胞也平行于拉伸方向，这一结果与现有文献一致。平行细胞与应变方向（3D水凝胶结构）的机制尚不*了解。然而，基于现有的理论，在拉伸的6%GelMA微凝胶的核心区域的平行细胞对齐可以在单细胞和多细胞水平上进行解释。
在单个细胞水平上的细胞对齐
初，细胞通过接触引导进行伸长和排列，这种现象是指细胞和肌动蛋白丝（细胞内的应力纤维）的取向主要由衬底的几何线索或衬底内的纤维决定(在3D水凝胶/静电纺丝纤维的情况下)。ECM纤维初与循环拉伸方向对齐，通过接触引导机制促进细胞沿着纤维的方向对齐。先前的研究表明，软胶原原纤维倾向于沿着应变施加的方向排列。因此，当将外部应变施加于我们的GelMA微凝胶时，微凝胶纤维可能已经向拉伸方向排列，这反过来可能要求细胞向类似的方向排列。
由于交联微凝胶阵列中的GelMA纤维初是随机的，并且没有暴露在任何动态机械拉伸条件下，细胞排列也是随机的，这也是一种接触引导现象。使用扫描电镜可以看到纤维的排列；然而，冻干过程可能会影响微凝胶，冻干平台的处理并不容易。
在3D水凝胶中，细胞不断地改变其形状，并与微环境机械地相互作用，以迁移或响应外力。这种细胞与其微环境相互作用的动态过程被称为黏合斑(FA)成熟，在此过程中，细胞不断地重塑其细胞骨架、周围的ECM网络，并通过FA（细胞机械转导的主要枢纽）与ECM的连接。这一过程也有助于细胞通过ECM纤维网络的迁移。一般来说，细胞对周围的水凝胶纤维网络施加收缩力，并在纤维拉长时收缩纤维。收缩力在基质内引起局部张力力，与细胞的收缩力保持平衡，从而保持平衡。
当一个外部动态应变被施加到一个富含细胞的水凝胶上时，它会在整个水凝胶中产生一个整体应变，从而导致纤维中的张力增加。为了保持系统平衡，细胞通过肌动球蛋白收缩过程增加收缩力。细胞收缩力的增加增加了细胞内的张力，并产生了成束的应力纤维（肌动蛋白丝），促进其FA成熟和向拉伸方向延伸/伪足的形成。此外，细胞的高收缩性导致水凝胶纤维的局部紧实应变增加；然而，细胞倾向于避免任何压力/应变。
6%GelMA微阵列的杨氏模量为6.6 kPa，通常被认为是柔顺性水凝胶。由于成纤维细胞本质上具有高度收缩性，它促进了FA成熟，并沿拉伸方向产生大量应力纤维。它还会产生较高的局部横向压实应变（由于6%GelMA的顺应性），其大小大于施加的应变。一方面避免局部应变，另一方面FA成熟过程的增加会导致6%GelMA微阵列中的成纤维细胞平行于拉伸方向重新定向。
在多细胞水平上的细胞对齐
上述理论描述了单个成纤维细胞如何沿着拉伸方向排列。然而，多细胞水平上的细胞排列分为三个阶段。先，单个细胞自身与拉伸方向平行排列，然后细胞在平行的方向上彼此排列。随后，细胞相互关联，形成一个与拉伸轴平行的绳状结构。细胞之间的紧密结合是高收缩性、FA成熟和避胁变性的结果。这种绳状结构使细胞看起来更细长，这可能是我们观察到包裹在6%拉伸GelMA微凝胶阵列中的成纤维细胞比6%对照GelMA微阵列中随机排列的细胞具有更高伸长程度的原因（图S2B，支持信息）。另一个重要的观察结果是，绳状结构主要出现在相对浓度较小的GelMA微凝胶中（图S2A-i，支持信息）。这是因为当细胞密度很高时，细胞间相互作用的几率很高所有方向都会发生粘附，防止形成清晰的绳状结构。当细胞间的粘附力更强时，细胞有可能形成网状图案。因此，在未来，在生物打印过程中控制细胞密度可以改善整个拉伸GelMA微阵列中绳状结构的形成。
细胞迁移能力与随机水凝胶纤维内的排列
细胞与拉伸方向的排列需要细胞在水凝胶内迁移。因此，细胞迁移是使细胞朝向施加应变方向重新定向的主要因素之一。细胞在3D水凝胶中的迁移可以用吊索短迁移（SSM）理论来解释。如前所述，成纤维细胞通过接触导向机制沿着水凝胶纤维伸出并极化。在此过程中，细胞经历肌动球蛋白收缩，并招募附近的水凝胶纤维来储存其弹性应变能。当施加外部应变时，其超过纤维张力，从而导致FA失效或接触细胞后缘。随后，纤维发生反冲，在此过程中，储存的弹性能被释放并转移到细胞中，使其朝拉伸方向移动。细胞的SSM主要在排列的纤维中观察到，而不是在随机纤维中观察到。因此，细胞重新定向可能是这两种理论的协同效应——水凝胶纤维向拉伸方向排列、避胁变性以及由于高肌动球蛋白收缩性而导致的更强ECM成熟。
沿GelMA微凝胶边界的周向细胞排列
控制细胞重定向的其他因素是应变率、频率、拉伸条件的持续时间和水凝胶的几何形状。从我们的结果来看，主要的重定向只观察到在GelMA微凝胶的核心区域；然而，细胞沿着其边界呈圆周排列。几何效应和施加的拉伸应变之间的竞争可能是导致核心和外围区域的细胞排列不同的原因。在GelMA微凝胶的边界上，几何效应(来自半球形的GelMA微凝胶)可以主导施加的拉伸应变，导致细胞沿周向对齐。同样，在核心区域，拉伸应变主导了几何效应，并重新定向了平行于应变的细胞。
不同刚度微环境中的离散细胞对齐
SSM理论的另一个重要结果是，细胞迁移的程度高度依赖于水凝胶基质的刚度。
此外，水凝胶刚度影响水凝胶内水凝胶纤维收缩、细胞收缩性、FA成熟度和横向压缩应变的水平，这就提出了一个问题，即当细胞封装在不同硬度的微环境水凝胶中循环拉伸时会如何反应。为了检查水凝胶微环境刚度和循环应变的组合效应，我们将6%、8.5%和11%的GelMA微凝胶打印在相同的复合膜基底上，然后以1Hz频率施加10%的应变，持续三天。
由于我们遵循GelMA合成的标准方案，且甲基丙烯酸化程度相似，因此我们没有测试水凝胶的降解性和溶胀率。许多以前的研究都很好地描述了这一点。由于我们的GelMA的甲基丙烯酸化率很高，约为91%，由于交联程度较高，我们预计GelMA的降解速度比之前研究中报告的要慢。在实验过程中或实验结束时，我们没有观察到打印的含有细胞的GelMA微凝胶的大小和形状有任何显著变化。水凝胶的可降解性总是与其刚度成反比。细胞在水凝胶内附着和增殖，形成3D细胞网络，从而降解水凝胶。细胞附着和伸长的能力取决于水凝胶的硬度。在较软的水凝胶中，成纤维细胞可以通过在3D环境中轻松牵引水凝胶纤维来牵引和拉长水凝胶纤维，从而局部降解水凝胶纤维。由于细胞不能在致密的微凝胶基质中伸长和增殖，因此细胞在坚硬的水凝胶中保持圆形，从而降低水凝胶的降解率。同样，水凝胶的刚度也会影响水凝胶的溶胀率。水凝胶浓度越高，水凝胶网络的交联密度越高，这限制了水的渗透速度和渗透量，进而减缓了水凝胶的降解。
基于上述假设，我们希望观察细胞排列趋势的差异。正如预测的那样，随着GelMA浓度的增加，我们观察到水凝胶的机械强度增加，孔径减小。几何效应在微凝胶的周边区域占主导地位，与GelMA的浓度和硬度无关，因此在所有三种情况下，细胞都沿圆周方向排列。然而，我们分别在6%、8.5%和11%拉伸富含细胞的GelMA微阵列的核心区域观察到平行、混合和垂直细胞取向。基于上述假设，细胞取向的这些差异可以再次得到解释：随着GelMA硬度的增加，细胞的收缩力不足以牵引和拉伸更硬的纤维。因此，由于细胞产生的收缩力较小，纤维中的张力较小，这显著降低了微凝胶中的局部横向压缩应变。此外，较硬的GelMA不会发生大量变形，导致压缩应力和应变沿着外部施加应变的方向发展。
在拉伸方向上增加的压缩应力和应变会导致细胞避开拉伸方向，因此在8.5%（中等硬度）和11%GelMA（高硬度）微凝胶的情况下，细胞会在混合和垂直方向上对齐。
细胞迁移能力也受到水凝胶硬度的影响。根据SSM理论，较软的水凝胶（6 kPa）中的细胞迁移速度比较硬的水凝胶快五倍（我们6%的凝胶硬度为6.6 kPa）。较硬纤维中缺乏张力会减少储存的弹性能，从而降低细胞迁移率。当复合膜以10%的应变拉伸时，我们还模拟了具有不同压缩杨氏模量的GelMA微凝胶中的应力分布。随着杨氏模量的增加，我们观察到微凝胶表面顶部沿拉伸方向和径向的应力水平增加（图S3，支持信息）。因此，模拟结果与我们关于细胞排列的假设一致。
除了细胞重新定向外，周期性拉伸使细胞能够形成高度接近体内条件的结构，并提高其分化能力和功能。这可能是观察到大量细胞在硬水凝胶中伸长和重新定向（拉伸时）的原因，这表明细胞经历了应变。然而，未拉伸的更硬的GelMA微凝胶（8.5%和11%）内的细胞没有太长。这些结果也与现有文献[32]一致，表明细胞不会在较硬的3D水凝胶中附着、伸长和增殖。一种可能的解释是，溶解度因子的扩散速率受到更硬的水凝胶中较小孔径的高度影响。
因此，在较硬的非拉伸微凝胶周围的细胞似乎伸长，因为它们具有大的扩散。细胞保持圆形的另一个原因可能是它们无法降解较硬的微凝胶基质。此外，刚性微凝胶纤维的也很难让细胞附着和伸长。然而，我们推测，动态刺激（在我们的例子中是循环拉伸）增强了更硬水凝胶内的细胞扩散，这与其他类似研究一致。进一步研究细胞功能，如机械传导和细胞间信号，以及拉伸和控制富含细胞的GelMA微凝胶阵列，将有助于确定存在机械刺激时水凝胶微环境特性对细胞行为的影响。
本实验拉伸平台和不同硬度的凝胶由MACH-1多功能微观力学测试仪进行自动高通量压痕测试得到杨氏模量。极大的方便了科学实验的进行和分析。
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